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1、1染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌细胞 SKOV作者：袁鹏，黄艳红，辛晓燕，宋晖，田爽，王德堂【关键词】 染料bined with cisplatin on drugresistant ovarian carcinoma cell SKOV3【Abstract】 AIM: To investigate the effects of genistein combined with cisplatin on the proliferation and apoptosis of drugresistant ovarian carcinoma cell SKOV3. METHODS: The grow
2、th inhibitory effect of genistein and cisplatin on SKOV3 cells was studied by MTT growth assay, the morphological alterations of SKOV3 cells were demonstrated by Hoechst 33342 staining under a fluorescence microscope and apoptosis and cell cycle distribution were detected by flow cytometry. RESULTS:
3、 Various concentrations of genistein in combination with cisplatin resulted in the reduction of IC50 by 32.3%-79.8% in SKOV3 cells. The combination index of genistein and cisplatin in SKOV3 cells ranged from 0.586 to 0.869, which indicated 2that they acted in a slightly to highly synergistic pattern
4、. The apoptotic rate was also significantly raised by combination of genistein and cisplatin, which showed a relationship with G2/M arrest and the disturbance of S phase because there was a negative correlation between apoptotic rate and G1 phase cell fraction（rs=-0.953, P0.05）. CONCLUSION: Genistei
5、n can significantly improve the growth inhibition and cytotoxicity effects of cisplatin on SKOV3 cells and the two agents act in a synergistic way. These synergistic effects may be related to the G2/M arrest and the disturbance of S phase by genistein.【Keywords】 genistein; cisplatin; ovarian neoplas
6、ms; drug synergism【摘要】 目的：探讨染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌细胞系 SKOV3 增殖与凋亡的影响. 方法：采用 MTT 比色法检测染料木黄酮和顺铂联用对 SKOV3 细胞增殖的影响， Hoechst 染色荧光显微镜下观察联合用药后细胞形态的改变，流式细胞仪分析细胞周期并检测凋亡率. 结果：联用不同浓度的染料木黄酮后顺铂对SKOV3 细胞 IC50 降低率为 32.3%79.8%,两药联合作用系数在0.5860.869 之间，为轻度至高度协同作用 . 染料木黄酮与顺铂联3用可显著提高凋亡率，两药联用诱导 SKOV3 细胞凋亡和阻滞G2/M 期、干扰 S 期进程，凋亡率
7、与 G1 期细胞比例呈负相关（rs=-0.953, P0.05）. 结论: 染料木黄酮可以增强顺铂对SKOV3 细胞的增殖抑制作用和杀伤作用，两种药物具有协同作用 . 染料木黄酮阻滞细胞于 G2/M 期并同时干扰 S 期进程可能是两药发挥协同作用的重要机制.【关键词】 染料木黄酮；顺铂；卵巢肿瘤；药物协同作用0 引言近年来染料木黄酮（4 ，5，7 三羟基异黄酮，genistein ）对肿瘤生长的抑制作用日益受到重视，尤其是它可以增强常规化疗药物的疗效1-2. 而染料木黄酮和传统化疗药物顺铂联用能否增强顺铂对耐药卵巢癌的杀伤作用呢？为此，我们研究了染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌 SKOV3 细
8、胞增殖与凋亡的影响及其机制 .1 材料和方法1.1 材料人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系 SKOV3 由西京医院妇产4科实验室保存，该细胞系对顺铂等多种药物耐药；RPMI 1640 培养基(Gibco 公司) ；新生牛血清(四季青公司)；顺铂(齐鲁制药厂)；染料木黄酮、二甲基亚砜（DMSO）,Hoechst33342(Sigma 公司) ；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Amresco 公司). 细胞周期检测试剂盒为DNAPrep Stain kit(BeckmanCoulter 公司 )；Wellscan MK3 型全自动酶标仪(Labsystems Dragon 公司) ；ELITE ESP 型流
9、式细胞仪（BeckmanCoulter 公司） .1.2 方法1.2.1MTT 法检测细胞增殖抑制率取对数生长期的 SKOV3 细胞，8103 个/孔接种于 96 孔培养板，置 37，50 mL/L CO2 培养箱培养 12 h，细胞贴壁后弃去培养液，然后加入含不同浓度药物的培养基 200 L：对照组只加 RPMI 1640 培养基(100 mL/L 小牛血清)；顺铂组加入顺铂浓度分别为 0.625，1.25，2.5，5，10，20 mg/L 的培养基；染料木黄酮组加入染料木黄酮浓度分别为2.5，5，10，20，30，40，50 mg/L 的培养基；染料木黄酮和顺铂联用组为 2.5，5，10，
10、20 mg/L 的染料木黄酮与顺铂联用，顺铂浓度同单药组，每组均设 6 个复孔. 继续培养至加药后 96 h，每孔加入 MTT(5 g/L,20 L),继续孵育 4 h 后弃培养液，每孔加入DMSO 150 L，振荡 10 min，用酶标仪检测各孔吸光值 (A490 nm)，按以下公式计算：细胞增殖抑制率=（对照组 A490 nm-实验5组 A490 nm）/对照组 A490 nm100%，取 6 复孔均值绘制抑制率与药物剂量关系曲线，按作图法求出半数抑制浓度（IC50）. 同时采用联合作用指数(combined index， CI)判断染料木黄酮和顺铂联用的性质. CI=DAICX,A+DB
11、ICX,B (A，B 代表两种不同药物，ICX,A 和 ICX,B 是两种药物单独使用使生长抑制率达 X 时的药物浓度，DA 和 DB 是两药联用使生长抑制率达 X 时两种药物的浓度)3. 根据 Soriano 等4 的判断方法，0.9CI1.1 为叠加作用，0.8CI0.9为低度协同作用，0.6CI0.8 为中度协同作用，0.4CI0.6为高度协同作用，0.2CI0.4 为强协同作用.1.2.2 荧光染色观察细胞形态的改变接种 SKOV3 细胞于盖玻片，置于六孔板内，细胞贴壁后加入不同药物，根据 MTT 结果分为4 组：即对照，顺铂（2.5 mg/L） ，染料木黄酮（10 mg/L）和染料木
12、黄酮（10 mg/L）+顺铂（2.5 mg/L）. 继续培养 36 h，固定后加入 0.5 mL Hoechst33342（10 mg/L） ，染色 15 min 后弃染液清洗，抗荧光淬灭液封片，紫外光激发，在荧光显微镜下观察.1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化收集 SKOV3 细胞，调整细胞密度为 5107/L，以每瓶 8 mL 接种于 75 mL 培养瓶，细胞贴壁后弃去培养液，加入含不同浓度药物的培养基. 根据 MTT结果，顺铂浓度选 2.5 mg/L, 染料木黄酮浓度选 5 和 10 mg/L，设对照、单药和联用共 6 组. 加药 36 h 后收集细胞，分别按DNAPrep
13、Stain Kit 试剂盒和 Apoptosis Detection Kit 试剂盒说6明书进行细胞固定、染色，上流式细胞仪分析.统计学处理： SPSS 11.0 软件进行秩相关分析.2 结果2.1 染料木黄酮与顺铂联用对 SKOV3 细胞增殖的影响染料木黄酮、顺铂单药的 IC50 分别为 30.0 mg/L 和 9.9 mg/L，4 种不同浓度的染料木黄酮与顺铂联用后顺铂的 IC50 明显降低，与单用顺铂组比较，4 种不同浓度的染料木黄酮可使顺铂的 IC50 分别降低到6.7，4.2，2.5 和 2.0 mg/L（图 1）. 当达到半数抑制时，不同浓度组合的染料木黄酮与顺铂的 CI 分别为0
14、.760，0.591，0.586，0.869. 其中 10 和 5 mg/L 染料木黄酮与顺铂联用达到高度协同作用；20.0 mg/L 和 2.5 mg/L 染料木黄酮与顺铂联用分别达到低、中度协同作用.2.2 染料木黄酮与顺铂联用后 SKOV3 细胞形态的改变对照组细胞核均匀淡染，界限清楚，呈正常结构(图 2A)；顺铂组与对照组无明显差异(图 2B)；染料木黄酮组可见少量凋亡细胞(图 2C)；联用组出现大量典型的凋亡细胞：细胞核染色明显增强，荧光更为明亮，强度深浅不一，并可见浓染致密的染色质凝集，呈颗粒状、固缩状或团块状结构（图 2D）.72.3 染料木黄酮、顺铂单药及联用对 SKOV3 细
15、胞周期及细胞凋亡的影响对照组绝大多数细胞处于 DNA 合成前期，G1 期细胞比例高，S 期和 G2 期细胞较少，凋亡率很低；2.5 mg/L 顺铂组对SKOV3 细胞周期和凋亡率无明显影响；5 和 10 mg/L 染料木黄酮组均成倍升高 G2/M 期细胞比例并增加凋亡率，10 mg/L 染料木黄酮还进一步的升高了 S 期细胞比例；2.5 mg/L 顺铂+5 mg/L 染料木黄酮和 2.5 mg/L 顺铂+10 mg/L 染料木黄酮组可使 G2/M 期阻滞和细胞凋亡得到显著加强. 各组 SKOV3 细胞 G1 期比例随着不同浓度染料木黄酮与顺铂的处理而改变，经直线相关分析，表明细胞凋亡和 G1
16、期细胞比例呈负相关（rs=-0.953, P0.05） ，与G2/M 期+S 期的细胞比例成正相关（表 1）. 表 1 不同浓度染料木黄酮与顺铂诱导的 SKOV3 细胞周期和凋亡率的改变 (略)3 讨论铂类药物是卵巢癌联合化疗方案中最常用的药物，而卵巢癌对铂类药物的耐药性及其毒副作用常常导致化疗方案难以奏效. 近年来研究表明染料木黄酮具有抑制肿瘤细胞生长、促进凋亡的作用，可以增强前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤细胞对化疗的敏感性，提高化疗的效果，而且可以在不降低疗效的前提下减少化疗药物用量，从而减轻化疗的毒副反应1-2. 那么染料木黄酮能否增强传8统化疗药物顺铂对耐药卵巢癌的疗效呢？在实验中我们发现 SKOV3细胞明显对顺铂耐药，其 IC50 达到 9.9 mg/L，远远超出顺铂的血浆峰值浓度（2.5 mg/L） ，而染料木黄酮与顺铂联用时则表现出不同程度的协同作用，可明显降低顺铂对 SKOV3 细胞的 IC50，10 mg/L 浓度以上的
