《木犀草素的体外抗炎机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《木犀草素的体外抗炎机制研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1木犀草素的体外抗炎机制研究【摘要】 【目的】观察木犀草素对脂多糖(LPS)诱导的 RAW2647细胞(小鼠单核 /巨噬细胞系)核因子 B(NFB)和环氧合酶2(COX2)表达及 NFB?DNA 结合活性的影响，探讨其体外抗炎机制。 【方法】以 RAW2647 细胞为研究对象，选用对数生长期的细胞，分别设空白对照组，脂多糖(LPS)处理组(模型组)，5、15 、45?mol/L 木犀草素处理组( 中药低、中、高剂量组) ；加入药物 30?min 后再加入终浓度为 1?g/mL 的 LPS 继续培养12?h，分别采用酶免疫测定法（EIA ）检测木犀草素对RAW2647 细胞前列腺素 E(PGE2
2、）生成的影响；电泳迁移率变动分析法(EMSA) 检测 NFB 的 DNA 结合活性；逆转录聚合酶链反应（RTPCR ）测定 RAW2647 细胞中 COX2 mRNA 的水平；Western blot 法测定 RAW2647 细胞中 NFB 和 COX2 蛋白的表达。 【结果】木犀草素能显著性抑制 LPS 诱导的 RAW2647 细胞 PGE2 的生成，降低 NFB 的 DNA 结合活性；下调 LPS 诱导的 RAW2647 细胞 COX2?mRNA、NFB 和 COX2 蛋白的表达。 【结论】木犀草素的抗炎作用可能与其能抑制核内 NFB 的表达和 DNA 结合活性从而下调 COX2 的表达有
3、关。 【关键词】 木犀草素/药理学；炎症/中药疗法；信号传导；基因表达调控；细胞培养 2【Objective】To investigate the invitro antiinflammatory mechanism of luteolin by observing the effect of luteolin on nuclear factorkappa B (NFB) and COX2 expression as well as DNAbinding activity of NFB in RAW2647 cells activated by lipopolysaccharides (LPS
4、). 【Methods】RAW2647 cells at logarithmic growth phase were allocated to blank control group, model group (treated with LPS) and luteolin groups (treated with 5, 15, and 45 mol/L luteolin respectively). After being treated with luteolin for 30 min and then incubated with 1g/mL LPS for 12 hours, the c
5、hange of prostaglandin E2 (PGE) level was observed by enzyme immunoassay (EIA), DNAbinding activity of NFB was detected by electrophoretic mobility shift assay (EMSA), mRNA expression of COX2 was examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR), and NFB and COX2 protein expression
6、 in RAW2647 cells was analysed by Western blotting. 【Results】Luteolin obviously inhibited the formation of PGE, decreased DNAbinding activity of NFB and downregulated mRNA expression of COX2 as well as 3NFB and COX2 protein expression in RAW2647 cells activated by LPS. 【Conclusion】The antiinflammato
7、ry mechanism of luteolin may be related with the downregulation of COX2 expression by inhibiting the expression of NFB and DNAbinding activity. Key words:LUTEOLIN/pharmacology;INFLAMMATION/TCD therapy;SIGNAL TRANSDUCTION；GENE EXPRESSION REGULATION；CELL CULTURE 木犀草素(Luteolin)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等
8、天然药物中，研究表明木犀草素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节等多种作用1-3 ，木犀草素的抗炎作用与其抑制炎症介质的释放和核因子 B（NFB ）介导的基因表达有关- 。本文观察了木犀草素对脂多糖(LPS)诱导的 RAW2647细胞 NFB 表达、DNA 结合活性以及对环氧合酶2(COX2) 表达的影响，以进一步探讨木犀草素抗炎的作用机理。 1 材料与方法 11 药品及试剂木犀草素（纯度 98%）和前列腺素 E2 酶免疫分析试剂盒（PGE2 EIA Kit）均为美国 Cayman 公司产品；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二甲基亚砜（DMSO） 、焦碳酸乙二酯4（DEPC）等为 Sigma 公司产品
9、；RPMI1640 为 Gibco 公司产品；超级小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；总 RNA 提取试剂（Trizol）为 Invitrogen 公司产品；逆转录聚合酶链反应（RTPCR ）一步法试剂盒为宝生物（大连）工程有限公司产品；100?bp?DNA?marker、N,N,N,N 四甲基乙二胺（ TEMED） 、6 倍上样缓冲液均为华美生物工程公司产品；增强化学发光（ECL）试剂、抑酞酶（Aprotinin）均购于上海华舜生物工程有限公司；actin 山羊 IgG 多克隆抗体、NFB 小鼠 IgG 单克隆抗体和COX2 山羊 IgG 多克隆抗体均为北京中山公司产品；聚偏 (二)氟乙烯
10、（PVDF ）膜为美国 Pall Gelman 公司产品；NFB 寡核苷酸链为上海生物工程公司产品；32P 标记三磷酸腺苷（32P ATP）为北京亚辉生物工程公司产品；T4 噬菌体多核苷酸激酶为Promega 公司产品。 12 方法 121 细胞培养 RAW2647 细胞(小鼠单核/ 巨噬细胞系)购自上海细胞研究所，在 37?、体积分数为 5%CO2 条件下，用含体积分数为 10%小牛血清、青霉素(1105?U/L)及链霉素(100?mg/L)的 RPMI1640 培养液传代培养。 122PGE2 含量测定将对数生长期的 RAW2647 细胞接种于 6 孔培养板中，设空白对照组，脂多糖（LPS
11、 ）处理组（模型组） ，5、15、45?mol/L 木犀草素处理组（中药低、中、高剂量组）；药物加入 30?min 后再加入终浓度为 1?g/mL 的 LPS，继续培养512?h；收集细胞培养液，以 PGE2 EIA Kit 测定其中的 PGE2 浓度，每组重复 3 次。 123 电泳迁移率变动分析(EMSA)细胞培养及分组同122。细胞核蛋白的提取：细胞以冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2 次后加入 100?L 缓冲液 A10?mmol/L?N2 羟基哌嗪N2乙磺酸（HEPES）-KOH、15?mmol/L?MgCl2 、10?mmol/L?KCl、1?mmol/L?苯甲基磺酰氟（PMSF） 、
12、10?mg/L?Leupeptin 、35?mg/L 抑酞酶（Aprotinin） 、1?mmol/L 二硫苏糖醇（ DTT） ，冰上放置15?min，再加体积分数为 10%壬基酚聚氧乙烯醚（NP40 ）10?L，振荡混匀；然后 10?000?g、4?、离心 10?min；于沉淀中加 100?L 缓冲液 B20?mmol/L?HEPESKOH 、27?mol/L?甘油（Glycerol ） 、420?mmol/L NaCl、15?mmol/L?MgCl2 、1?mmol/L?PMSF、1?mg/L?Leupeptin、10?mg/L?Aprotinin、1?mmol/L?DTT ，冰浴 30?
13、min，离心取上清液，考马斯亮蓝法测定核蛋白浓度后，70?保存。广州中医药大学学报 2007 年第 24 卷第 3 期张毅，等.木犀草素的体外抗炎机制研究双链寡核苷酸探针的标记：含有 NFB 特异性识别位点的双链脱氧寡核苷酸序列如下:5AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3；3TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5。依次加入寡核苷酸探针(10?pmol /L)10?L、10 倍 T4 多核苷酸激酶缓冲液 2?L、T4 多核苷酸激酶6(10?U /L)10?L、 32P-ATP (10?Ci/L)25?L、无核酸酶水 135?L，共 20?L。反应混合液于 37孵育 10?min
14、，加入05?mmol/L 乙二胺四乙酸 (EDTA)1?L 终止反应。乙醇沉淀法去除未结合标记物。 取 10?g 核蛋白与放射性核素标记的 DNA 探针在室温进行结合反应 30?min，总体积为 10?L。DNA 蛋白复合物经 40?g/L 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压 110?V，电泳60?min。真空负压加热干燥凝胶后，70?放射自显影，显影后扫描至计算机。用 Bandscan 43 图像分析软件进行光密度积分值分析。每个图像均重复分析 3 次，取平均值。 124RTPCR 测 RAW2647 细胞中 COX2?mRNA 的表达 RAW2647 细胞分组及处理同 122。收集细胞，用
15、Trizol试剂提取细胞的总 RNA，按一步法试剂盒步骤进行RTPCR。COX2 引物为：上游5GGGAAGCCTTCTCCAACC3，下游5GAACCCAGGTCCTCGCTT3，产物长度为245?bp；actin 引物为：上游 5 CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC3，下游 5 AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC3，产物长度为587?bp。COX2 的反应条件为： 50?逆转录 30?min；94?预变性 2?min；94?变性 45?s，56?复性 1?min，72?延伸1?min，扩增 30 个循环；72 延伸 10?min。PCR 产物以 15?g/L琼脂糖凝胶电泳，Doc Gel 1000 成像系统观察结果并拍照。同时进7行光密度积分值分析，以 COX2 PCR 产物与内参照 actin PCR产物的光密度积分值之比作为 COX2 mRNA 的相对含量值。 125Western blot 测 RAW2647 细胞中 COX2 和NFB 蛋白的表达 细胞处理同 122，细胞裂解液裂解细胞后提取总蛋白，考马斯亮蓝法测定样品总蛋白含量。每组各取 50?g 蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行 100?g/L 十二烷基硫
