生物制品检验技术实验

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1、本科生课程实验（ 生物工程 专业 10 年级 1 班 ）实验名称生物制品基本成分测定姓名：王帆同组人姓名：王兆、庄琳、卢扬、梁美兰二一二年十一月目录一、绪论1二、实验92-1 实验目的 92-2 实验原理92-3 仪器药品102-4 实验步骤102-5 数据记录与处理132-6 结果与讨论142-7 结束语15三、参考文献15一、绪论生物制品中文名称：生物制品英文名称：biological product定义：一类用于疾病诊断或防治的制剂。生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、

2、治疗和诊断的药品。 生物制品不同于一般医用药品，它是通过刺激机体免疫系统,产生免疫物质（如抗体）才发挥其功效，在人体内出现体液免疫、细胞免疫或细胞介导免疫。生物制品的种类：根据采用的材料、制法或用途不同，可分为六类：疫苗类药物、抗毒素及抗血清类药物、血液制品、重组 DNA 制品、诊断制品以及其他制品。生物制品是药品的一大类别，但生物制品的其实材料都具有生物活性、其制备过程是无菌操作的生物学过程，并以生物学技术和分析技术来控制其原料，中间品及成品的质量。因此，应根据生物制品生产和质量管理的固有特性，对生物制品的特殊要求进行规定。药品：指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规定

3、有适应症，用法和用量的物质。 （包括材料、重要饮片、中成药、化学原料及其制剂、抗生素、生化药品、放射性药品、血清制品和诊断药品等）生物制品检验技术生物制品检验的性质和任务性质：用化学、物理化学或生物化学的方法和技术来研究生物制品的质量及其控制方法，是一门研究和开发生物制品及其质量控制的“技术学科” 。主要包括：生物制品形状的检测、生物制品化学组成的检测、物制品杂质限量的检测、生物制品含量的检测等。任务：生物制品的常规检验：以“生物制品质量全面监控”为中心，开展生物制品质量检验成品检验(原料,制剂)生产过种种质量控制(中间体),优化工艺贮藏过程中的质量控制(稳定性考察)为新制品研究开发提供科学的

4、质量控制方法新制品开发及新剂型质量及稳定性研究天然产物活性成分的化学结构确证现代生物计数所研制的生物制品质量标准研究由于生物制品具有：分子量不是定值、生化法结构确证、需检查生物活性、要求安全性检查、需做效价测定的特点。其化学性质与生物学性质都很不稳定，又易受微生物污染，故对生物制品的均一性、有效性、安全性和稳定性等应有严格要求，以生产出具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小，疗效可靠及营养价值高等特点的安全、高效的生物制品。为此，必须进行原材料、生产过程和最终产品的全程质量检验、控制，以确保产品符合质量标准要求。分子量不是定值：大部分生物制品的活性组分均为大分子的生命物质（如蛋白质、多肽、

5、核酸、多糖类等） 。组分相同，但相对分子量不同而产生不同的生理活性，因此常需进行相对分子量的测定。生化法结构确证：由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用化学药物或结构已知的生化药物所常用的方法，还需要生物化学分析如：氨基酸组成、N 末端氨基酸序列、肽图等需检查生物活性：生物制品对热、酸、碱、重金属及 pH 等变化敏感，各种理化因素的变化易对生物活性产生影响。特别是多肽和蛋白质。除理化分析，还需生物检定，防止蛋白质失活要求安全性检查：物制品组分复杂，有效成分浓度很低，生物大分子杂质含量比较高，生产工艺复杂，易引入特殊杂质和污染物。如重组乙型肝炎疫苗涉及的安全性检查包括：细胞外源因子检查

6、、原液、半成品、成品中有关血清白蛋白残留量、CHO 细胞 DNA 残留量检查、热原检查、过敏试验、异常毒性检查等。需做效价测定 ：对于生物制品有效成分的检测，除应有一般化学方法或理化分心进行有效成分含量测定外，更应根据产品的特异生理效应或专一化反应拟定其专属性的生物效价测定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。生物制品批签发管理办法规定：对每一批次的疫苗类制品、血液制品、用于血源筛查的体外生物诊断试剂以及国家食品药品监督管理局规定的其他生物制品，在出厂上市或者进口时进行强制性检验、审核。检验不合格或者审核不被批准者，不得上市或者进口。课程实验此次生物制品检验技术实验主要包括生物制品中水分的测定

7、、生物制品中蛋白质含量的测定、氨基酸的分离鉴定。生物制品中水分、蛋白质、氨基酸的基本研究水分测定：水分：干燥制品中水分含量的高低，直接会影响冻干制品的质量和保存效期。冻干血浆水分含量越低越好，能使保存期延长，不易变性。活菌苗含水量过高，易造成活菌死亡或蛋白质变性使制品失效。但含水量过低，能使菌体脱水，同样会造成活菌死亡，降低效力。直接干燥法：基于生物制品中的水分受热后，产生的蒸汽压高于空气在电热干燥箱中的分压，使制品中的水分蒸发出来，同时，由于不断的加热和排走水蒸气，而达到完全干燥的目的，制品干燥速度取决于整个压差的大小。 测定时样品必须磨碎，全部经过2040目筛，混匀。在磨碎过程中，要防止样

8、品水分含量变化。一般水分在14%以下时称为安全水分，即在实验室条件下进行粉碎过筛等处理，水分含量一般不会发生变化。但要求动作迅速。制备好的样品存于干燥洁净的磨口瓶中备用。测定时，要精确称取上述样品210 g（视样品性质和水分含量而定） ，置于已干燥、冷却并称至恒重的有盖称量瓶中，移入95105常压烘箱中，开盖24小时后取出，加盖置干燥内冷却0.5小时后称重。再烘1小时左右，又冷却0.5小时后称重。重复此操作，直至前后两次质量差不超过2mg 即算恒重。本实验采用直接干燥法！卡尔费休法：1935年由卡尔费休提出，采用 I2、SO2、吡啶、无水 CH3OH（含水量在0.05%以下）配制成试剂，测定出

9、试剂的水当量，在试剂与样品中的水进行反应后，通过计算试剂消耗量而计算出样品中水含量，国际标准化组织把这个方法定为测微量水分国际标准，我们国家也把这个方法定为国家标准测微量水分。 1、原理：在水存在时，即样品中的水与卡尔费休试剂中的 SO2与 I2产生氧化还原反应。 I2 + SO2 + 2H2O 2HI + H2SO4 此反应是可逆反应，当硫酸浓度达到0.05%以上时，即能发生逆反应。若要让反应按照一个正方向进行，需要加入适当的碱性物质以中和反应过程中生成的酸。经实验证明，在体系中加入吡啶，这样就可使反应向右进行。 2、3 C5H5N+H2O+I2+SO2 2氢碘酸吡啶 + 硫酸酐吡啶 生成硫

10、酸酐吡啶不稳定，能与水发生反应，消耗一部分水而干扰测定，为了使它稳定，可加无水甲醇。 3、硫酸酐吡啶 + CH3OH（无水） 甲基硫酸吡啶 4、上面三步反应写成总反应式为：I2+SO2+H2O+3吡啶+CH3OH 2氢碘酸吡啶+甲基硫酸吡啶 5、从反应式可以看出1mol 水需要1mol 碘，1mol 二氧化硫和3mol 吡啶及1mol甲醇而产生2mol 氢碘酸吡啶、1mol 甲基硫酸吡啶。这是理论上的数据，但实际上，SO2、吡啶、CH3OH 的用量都是过量的，反应完毕后多余的游离碘呈现红棕色，即可确定为到达终点。 6、I2SO2C5H5N = 1310 卡尔费休试剂的配制与标定 若以甲醇作溶剂

11、，则试剂中I2、SO2、C5H5N（含水量在0.05%以下）三者的克分子数比例为：I2SO2C5H5N = 1310 这种试剂有效浓度取决于碘的浓度。新配制的试剂其有效浓度不断降低，其原因是由于试剂中各组分本身也含有一些水分，但试剂浓度降低的主要原因是由一些副反应引起的，较高消耗了一部分碘。 这也说明了配制这种试剂要单独配，分甲乙两种试剂并且分别贮存，临用时再混合，而且要标定。但目前我国市场上使用的卡尔费休水份测定试剂，无论是单组份的，还是双组份的一般都由厂家已经调配好的可直接使用产品，但由于卡尔费休试剂是一种很不稳定的混合物质，因此用户在使用时都必须进行标定，以测定其真实的水当量数据。卡尔费

12、休法测定水份，需要注意如下几点： 此法适用于多数有机样品，包括食品中糖果、巧克力、油脂、乳糖和脱水果蔬类等样品； 样品中有强还原性物料，包括维生素 C 的样品不能测定；样品中含有酮、醛类物质的，会与试剂发生缩酮、缩醛反应，必须采用专用的醛酮类试剂测试。对于部分在甲醇中不溶解的样品，需要另寻合适的溶剂溶解后检测，或者采用卡氏加热炉将水份汽化后测定。 卡尔费休法不仅可测得样品中的自由水，而且可测出结合水，即此法测得结果更客观地反映出样品中总水分含量。 固体样品细度以40目为宜，最好用粉碎机而不用研磨，防止水分损失。蛋白质：蛋白质是含氮有机物，自然界中的蛋白质含氮比较稳定，平均含量约为 36%，即，

13、100 克蛋白质平均含氮 16 克。因此在测定生物样品的蛋白质含量时，可先测定样品中的含氮量，再乘以系数 6.25，便可以换算成蛋白质含量。目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（ Bradford） 、Folin 酚试剂法。这五种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点。各种蛋白质含量测定方法比较 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明凯氏定氮法灵敏度低，使用于0.2-1.0mg氮，误差为2%费时，8-10 小时，但如果采用凯氏定氮仪，缩短时间至4 个小时将蛋白氮转化为氨气，然后用酸吸收滴定非蛋白氮（可用三氯乙

14、酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费时，如果采用凯氏定氮仪，就会大大缩短定氮时间双缩脲法灵敏度低，1-20mg中速 20-30 分钟多肽键+碱性 Cu2+紫色络合物硫酸铵：Tris缓冲液，某些氨基酸用于快速测定，但不灵敏，不同蛋白质显色相似紫外吸收光法较为灵敏，50-100 微克快速 5-10分钟蛋白质中的络氨酸和色氨酸残基在280nm 处德光吸收各种嘌呤和各种核苷酸用于层析柱流出液的检测，核酸的吸收可以校正考马斯亮蓝法灵敏度最高，1-5 微克快速 5-15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其 max由 465nm 变为 595nm强碱性缓冲液，TritonX-100S

15、DS最好的方法，干扰物质少，颜色稳定，灵敏度高颜色深浅随不同蛋白质变化Folin酚试剂法灵敏度高，5 微克慢速 40-60 分钟双缩尿反应，磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr 和 Phe还原硫酸铵，Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化双缩脲法：实验操作简便迅速,但其缺点是灵敏度较低,蛋白质量须在120mgPmL 时测定结果较准确。双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。紫外吸收法：简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。此法测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故本法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果