马铃薯腐烂茎线虫对低剂量杀线虫剂的_适应性研究硕士论文

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1、湖南农业大学硕士学位论文马铃薯腐烂茎线虫对低剂量杀线虫剂的适应性研究罗 杰二 0 一四年五月分类号 密 级 U D C 单位代码 10537 湖南农业大学硕 士 学 位 论 文马铃薯腐烂茎线虫对低剂量杀线虫剂的适应性研究Adaptability research of Ditylenchus destructor response to low dose of nematicides研 究 生 姓 名 罗 杰 指 导 教 师 丁中 副教授学 科 专 业 农药学研 究 方 向 农药毒理及有害生物抗药性提交论文日期 论文答辩日期 答辩委员会主席 论文评阅人 学位授予日期 二一四年五月独 创 性 声

2、 明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名： 时间： 年 月 日关于论文使用授权的说明本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文

3、的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名： 时间： 年 月 日导师签名： 时间： 年 月 日I摘 要热激蛋白70（Heat shock proteins，Hsp70s）是热激蛋白家族中最重要的一类家族成员，广泛存在于原核生物和真核生物的细胞区室和器官中，其序列高度保守。马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）是引起植物病害的重要病原物之一，每年给农业生产带来巨大的损失。杀线虫剂施用后主要以低剂量的形式存在于土壤中。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）三个热激蛋白70基因，分别

4、命名为Dd-Hsp70-A（GenBank 登录号KF792307） 、 Dd-Hsp70-C（GenBank登录号JQ422276）和Dd-Hsp 70-F（GenBank登录号JQ422277 ） ，并利用Real-time PCR检测了马铃薯腐烂茎线虫经低剂量（10、1、0.1、0.01和0.001g/mL）杀线虫剂阿维菌素、丙溴磷和涕灭威处理24h后，三个热激蛋白70基因表达量的变化。结果表明，Dd-Hsp70-A 基因的cDNA 全长为2081bp，开放阅读框为1938bp，编码了645个氨基酸；Dd-Hsp70-C基因的 cDNA全长为2436bp，开放阅读框为2019bp，编码了

5、672个氨基酸；Dd-Hsp70-F基因的cDNA全长为2092bp，开放阅读框为1959bp，编码了652个氨基酸。同源性分析结果表明，三个基因与其他线虫的热激蛋白70基因具有较高的同源性，含有HSP70家族高度保守的基序。Dd-Hsp70-A 的基因组由 11个外显子和10个内含子组成；Dd-Hsp 70-C的基因组由13个外显子和12个内含子组成；Dd-Hsp70-F的基因组由11个外显子和10个内含子组成。蛋白质预测结构表明，克隆所得的三个基因在N 端均形成了ATP酶结构域，在近C端均形成了底物肽结合结构域和C端结构域。qRT-PCR分析结果表明，经热激及低剂量阿维菌素、丙溴磷和涕灭威

6、处理后，Dd-Hsp70-A 基因与对照组相比较出现较明显的上调表达，Dd-Hsp 70-C基因和Dd-Hsp70-F 基因的表达与对照组相比较无显著性差异（P0.05） 。由此推测Dd-Hsp70-A基因为诱导型，Dd-Hsp70-C基因和Dd-Hsp70-F基因为组成型。生物学特性研究结果表明，残留在土壤中的阿维菌素对马铃薯腐烂茎线虫的影响较小，而涕灭威药剂对马铃薯腐烂茎线虫的影响相对较大。结果为深入研究植物寄生线虫在低剂量杀线虫剂处理下的应对机制提供了基础资料。关键词：马铃薯腐烂茎线虫，热激蛋白 70，杀线虫剂，基因表达IIAbstractHeat shock protein 70 kD

7、a (Hsp70s) is the most important proteins among of heat shock proteins，which are widely existsd in cell chamber and organs of both prokaryotes and eukaryotes with a highly conserved sequencePotato rot stem nematode(Ditylenchus destructor) is one of important pathogens of sweet potato in China, and t

8、he enormous yield losses to agriculture is very great annually. After the nematicide application，rudimental nematicide exists mainly in the form of low-dose in soil.In order to understand the effect of low does of nematicides on Hsp70s mRNA expression，three Hsp70 genes ，Dd-Hsp70-A (GenBank accession

9、 NoKF792307)、Dd-Hsp70-C (GenBank accession NoJQ422276 ) and Dd-Hsp70-F (GenBank accession NoJQ422277)，were cloned from Ditylenchus destructor using RT-PCR and RACE techniques，and the mRNA expression levels of D.destructor treated by low dose (10、1、0.1、0.01、0.001g/mL) of abamectin, profenofos and ald

10、icarb were analyzed using Real-time PCR after 24 hThe full-length cDNA of Dd-Hsp70-A was 2081 bp which with anopen reading frame (ORF) of 1938 bp and encoding 645 amino acids residues；the full-length cDNA of Dd-Hsp70-C was 2436 bp with an open reading frame (ORF) of 2019 bp encoding 672 amino acids

11、residues； the full-length cDNA of Dd-Hsp70-F was 2092 bp，which with anopen reading frame (ORF) of 1959 bp encoding 652 amino acids residuesHomology analysis indicated that thosethree genes all contained a highly conserved sequence of Hsp70 family and were highly homologous to Hsp70genes in other nem

12、atodesThe structure of Dd-Hsp70-A,Dd-Hsp70-C and Dd-Hsp70-F genomic include 11 extonsand 10 introns，13 extonsand12 introns，11 extonsand 10 introns,respectivelyThe predicted protein structure showed that the three genes all had ATPase fragment at the N-terminal and developed substrate peptide and C-t

13、erminal domains near the C-terminalAfter treated by heat shock and low dose emanectinbenzoate，profenofos and aldicarb，the expression levels of Dd-Hsp70-A increased significantly compared with control，while Dd-Hsp70-C and Dd-Hsp70-F showed no significant IIIdifference（P0.05）It is speculated that Dd-H

14、sp70-A is inducible，Dd-Hsp 70-C and Dd-Hsp70-F are constitutiveThe results presumed that emamectin benzoate which residues in soil has less effects on D. destructor, aldicarb has more effects on D. destructor.The results provide useful information for further research mechanisms of nematodes response to low dose of nematicidesKeyword：Ditylenchus destructor，Hsp70s，nematicide，gene expressionIV目 录第一章 文献综述 .11 马铃薯腐烂茎线虫研究进展 .11.1 马铃薯腐烂茎线虫简介 .11.2 传播途径及症状特点 .