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1、毕赤酵母发酵手册总览简介：毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度，我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于 Mut+和 Muts 两种基因型的毕赤酵母菌株在 15L 的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就是整个指导的概况。步骤 标题 页码1 发酵参数 12 设备推荐和培养基的制备 23 培养中溶氧的测量和使用 34 种子液的培养 45 在分批和分批补料培养中生物量对应
2、于甘油的生成4-56 Mut+和 Muts 基因型重组子在甲醇分批补料状态下表达的介绍6-77 细胞的成熟与衰退 88 参考文献 9-109 配方 11发酵参数：在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参数和监测这些参数的原因。参数 原因温度（30） 在 32以上的温度下生长不利于蛋白质的表达溶氧（20） 毕赤酵母利用甘油和甲醇需要氧气pH（5.0-6.0 和3.0）对于外源蛋白分泌到培养基中和最适生长非常重要转度（500-1500rpm）使培养基中的氧浓度达到最大值通气（玻璃发酵罐中为 0.1-1.0vvm ）使培养基中的氧浓度达到最大值取决于容器消泡剂（消除泡沫的最
3、小量）过多的泡沫会引起分泌蛋白质的降低和罐顶空间的减少碳源（变化率） 在发酵过程中要以不同的速率添加不同的碳源 每分钟 1 体积发酵液（L）中氧气的体积（L）设备推荐：下面是所推荐设备的清单：发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10） 。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。一个氧气的来源空气（不锈钢的发酵罐需要 1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要 0.1-0.3vvm） 。添加甘油和甲醇的补料泵。pH 的自动控制。培养基的准备：你需要准确配置下列溶液：发酵所需的基本盐类（第 1
4、1 页）PTM1 补充盐类（第 11 页）75ml 的 50的甘油每升初始发酵液，12ml 的 PTM1 补充盐每升甘油。740ml 的 100的甲醇每升初始发酵液，12ml 的 PTM1 补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定：在不同的时间点通过测 OD600 的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。溶氧的测定：简介：溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧 100是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维
5、持在一个适当的水平（20）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。溶氧浓度的维持：1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在 20，特别是在小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为 0.1-0.3vvm（1L 发酵液每分钟 1L 氧气）来提供氧气使 DO 保持在 20。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。2、在通气为 0.1-0.3vvm 时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发
6、酵罐中，压力可增加 OTR（与KLa 有关） 。3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。DO 测量的用处：在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使 DO 浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO 浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导 AOX1 启动子，确定碳源是否受抑
7、制就非常重要。例如：DO 浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（1-2vvm ）可能会产生毒害。DO 的调控：如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO 值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO 值上升 10。如果延迟时间很短（1min） ，说明碳源受抑制。发酵的准备和甘油批式发酵发酵种子液的摇瓶培养：记住不要向摇瓶中加入太多的培养基，培养基体积应该在摇瓶总体积的 10-30左右。1、 摇瓶中包含约为初始发酵液体积 5-10的从 MD 或 MGY 平板上的一个菌落
8、或者冷冻甘油储藏液中接种的 MGY 或 BMGY。2、 摇瓶应该 30，250-300rpm 的摇床上培养 16-24h 直到 OD600=2-6。为了精确的测量 OD6001.0，在读数前将样液稀释 10 倍。甘油批式发酵：1、将发酵罐和包含 4甘油的发酵基础盐类培养基灭菌。2、在灭菌和冷却后，待温度降至 30时，开启搅拌和通气至操作环境（通常为最大转速和 0.1-1.0vvm）并用 28的氨水（未稀释）将培养基的 pH 调整到 5.0。每升培养基中加入 4.35ml 无菌的 PTM1 基础盐类。3、从种子液摇瓶中接种初试发酵体积 5-10的种子液到发酵罐内。请注意在培养开始先 DO 值接近
9、于 100。当开始培养后会消耗氧气，导致DO 值下降。请添加所需氧气以确保 DO 值超过 20。4、进行批式发酵直到甘油被完全消耗（18-24h） ，标志是 DO 值增加到100。请注意甘油完全消耗的时间会随着初试发酵液密度而变化。5、每个发酵阶段的完成都需要进行取样，并且每天至少两次。每个时间点取 10ml 样品，并从 10ml 中另取出 1ml 样品。样品用于分析细胞的生长（OD600 和细胞湿重） ，pH，显微观察，蛋白质的浓度或活性。将菌体和上清（离心后）在-80下保藏，用于后面的分析。再进行第 5 页的甘油补料培养。产量：这个阶段所期望达到的细胞产量为 90-150g/L 湿细胞。重
10、组蛋白质由于缺乏甲醇的诱导而不会产生。甘油补料培养介绍：一旦所有的甘油在批式发酵培养中耗尽，甘油的补料需要马上开始来在限制条件下增加细胞生物量。当你准备进行甲醇诱导时，你需要通过 DO 值来确定甘油已耗尽。甘油补料培养：1、加入 50w/v 的每升含 12mlPTM1 的甘油进行补料。将补料速率设为18.15ml 每小时每升初试发酵液体积。2、甘油补料将进行约 4h 或更长。在本阶段完成后细胞产量应达到 180-220g/L 湿细胞但是不会有重组蛋白质的产生。注意：蛋白质的表达水平依赖于在甘油补料培养中所产生的细胞量。补料持续时间将会变化来使蛋白质的产量达到最优，建议的大致的范围为 50-30
11、0g/L 湿细胞。4甘油的是所建议的在补料中的最大水平，更高的甘油浓度将会产生毒害问题。重要：如果溶氧低于 20，应该停止甘油或甲醇的补料并且不做任何提高溶氧的事直到溶氧稳定。这时开始调整搅拌、通气、压力或氧气的补充。蛋白酶：在文献中，有报道称如果培养基的 pH 低于 3.0，中性蛋白酶会被抑制。如果你认为中性蛋白酶降低了你的蛋白质的产量，在甘油补料培养中或者在甲醇诱导的开始阶段将 pH 控制设定点改为 3.0 并且允许培养的代谢活动在低于3.0 的 pH 条件下进行 4-5h（Brierley，et al.，1994；Siegel，et al.，1990） 。甲醇补料培养简介：在甲醇补料来充
12、分诱导 AOX1 启动子前左右的甘油都必须消耗干净。然而，有报道称甘油和甲醇的混合补料已经成功的表达了重组蛋白质（Breerley，et al.，1990；Sreekrishna，et al.，1989） 。慢慢的流加甲醇来使培养适应在甲醇中生长非常重要。如果甲醇加德太快将会杀死细胞。一旦培养物适应了甲醇，用DO 值来分析培养的状态并且来确定甲醇流加的时间点来使蛋白质的表达达到最优。在甲醇上生长液会产生大量热量。所以这个阶段温度的控制非常重要。Mut+型菌株的甲醇补料培养：1、终止甘油的补料并且开始用含 12mlPTM1 基本盐类每升的 100的甲醇进行诱导。设定补料速率为 3.6ml/h 每
13、升初试发酵液体积。2、在开始的 2-3h 内甲醇会在发酵液中累积，培养物适应甲醇的过程中溶氧值会有变化。3、如果 DO 值不能维持在 20以上，停止流加甲醇，等到 DO 值稳定后继续以当前速率流加甲醇。增加搅拌、通气、压力或者氧气的补充来使 DO 维持在 20以上。4、当培养物完全适应利用甲醇（2-4h）并且甲醇成为其限制性生长因子后，将会有一个稳定的 DO 读数和一个较快的 DO 稳定时间点（通常不到 1min） 。在培养物适应甲醇后而将流加速率翻倍前在限制条件下保持这个较低的流加速率最少 1h。然后流加速率增加一倍到约 7.3ml/h 每升初始发酵液体积。5、在以 7.3ml/h/L 的速
14、率流加 2h 后，增大甲醇流加速率到 10.9 ml/h 每升初始发酵液体积。这个流加速率贯穿剩余发酵过程。6、整个甲醇补料培养一共加入接近 740ml 每升发酵液初始体积，持续差不多70h。然而，这个针对不同的蛋白质可能会有一些变化。产量：在甲醇补料培养中细胞浓度会最终增加到 350-450g/L 湿细胞。记住这些因为大多数的发酵都在进行补料培养模式，最终的发酵体积会接近于 2 倍初始发酵体积。Muts 型毕赤酵母菌株的发酵：因为 Muts 型培养物代谢甲醇不充分，他们的氧气消耗就非常低。因此，你不能利用 DO 值来估量培养。在 Muts 型菌株的标准发酵中，调整甲醇流加速率来保持培养基中的
15、不超过 0.3（可以由气象色谱分析来确定）的过量甲醇。当气象色谱分析确保甲醇维持在无毒害水平，我们在有经验的指导下来进行 Muts型菌株的蛋白质的表达。气象色谱分析对于分析和优化 Muts 型重组菌株的生长非常有帮助。甲醇补料培养，接上Muts 型菌株的甲醇补料培养:Muts 型菌株的甘油批式培养和甘油补料培养这两个阶段按照 Mut+型菌株所描述的发酵。Mut +型和 Muts 型在甲醇诱导阶段的区别主要是方法和培养过程中甲醇流加的总量。1、 在开始阶段流以 1ml/h 每升初始发酵液体积的速率流加每升含12mlPTM1 基础盐类的甲醇 2h。然后每 30min 增加 10直到 3ml/h的速
16、率，以此速率保持整个发酵过程。2、 发酵在甲醇诱导约 100h 后放罐。时间可能因蛋白质表达的优化而变化。细胞的成熟与衰退：简介：方法和设备不完全的列在下面。细胞的总量或上清液的体积将会决定你需要哪种设备。收获细胞和上清液：在小型发酵罐（1-10L ）中，培养物可以被手机到离心管（500-1000ml）中，再到离心管中将细胞从上清液中分离出来。在大型发酵罐中，大型的膜过滤单元（微孔）或 Sharples 离心机可用于将细胞从上清液中分离出来。最合适的方法依赖于你需要细胞还是上清液作为你想要表达的蛋白质的来源和你可以利用到什么。上清液可以直接装载到适当的蒸馏塔中或通过超滤来浓缩。细胞的衰亡：我们建议用玻璃粉来进行细胞破碎。这个方法对于大量的细胞来说可能显得繁冗。遂于大量的细胞，我们发现用乳化技术效果很好。French 式压碎细胞看上去效果没有玻璃粉或者如花技术那么好。BMGY 基本培养基：对于 1L 的培养基，将
