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1、第二节分子生物学技术,学习导航1.尝试PCR(DNA聚合酶链式反应)技术的基本操作。(重难点)2体验PCR这一常规分子生物学实验方法。(难点)3理解PCR的原理，讨论PCR技术的应用。(重点),生物转化环节,DNA重组,工程菌,2.原核生物、真核生物的细胞已被用于大批量生产_、_等外源蛋白；植物和动物也可以作为天然的_，用于生产新的或改造过的基因产物。DNA重组技术还大大简化了新药的开发和检测系统。,胰岛素,干扰素,生物反应器,(1)工程菌是指用DNA重组技术的方法使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。()(2)克隆羊“多利”是分子生物学的发展的成果。(),判一判,二、PCR技术(聚合酶链式反
2、应)1.PCR技术的含义在体外快速扩增_或DNA序列(目的DNA片段)的实验技术，又称为聚合酶链式反应。2.PCR技术的原理(1)条件：DNA模板、_、_、4种脱氧核苷酸。,特定基因,DNA聚合酶,引物,(2)PCR扩增的特点：_、简便和_。(3)进行PCR的先决条件：待扩增的DNA片段_要为已知。(4)引物序列确定的依据是：被扩增区域的3端边界DNA序列。,快速,灵敏,3端核苷酸序列,1在PCR反应中与解旋酶作用相同的操作是什么？提示：生物体外，利用DNA的热变性原理：94 时DNA的双螺旋结构将解体，双链分开。,想一想,三、PCR扩增的过程1.物质条件(反应成分)(1)引物：两种_，每种由
3、1540个核苷酸聚合而成。(2)反应物：4种_(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。(3)DNA聚合酶：常用的DNA聚合酶是从一种嗜热菌中分离得到的_。,寡核苷酸,脱氧核苷酸,Taq聚合酶,(4)模板DNA：既可来源于动物、植物、微生物，也可来源于人工合成。(5)Mg2：提供DNA聚合反应的离子条件。(6)_ ：提供反应的溶液体系。2.PCR扩增过程变性退火延伸(1)变性：在94 高温下作为模板的双链DNA_成为单链DNA。,反应缓冲液,解旋,(2)退火：反应体系的温度降至4060 ，使得_与作为模板的单链DNA上特定部位相互配对、结合。(3)延伸：反应体系的温度回升到72 左右，在单链
4、上4种脱氧核苷酸按照_的原则连接在引物之后，使引物链延伸，形成互补的_。,引物,碱基互补配对,DNA双链,想一想2某考古学家在冰中发现了一种已经灭绝的巨型动物的肌肉，采取什么方法可以判断该动物与现今大象的DNA相似？提示：用PCR技术扩增该动物的DNA，与大象的DNA进行比较。,特别提醒DNA母链的3端对应着子链的5端，即DNA的两条链是反向平行的。解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都可催化形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3羟基上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。,在PCR反应中，加入的四种脱氧核
5、苷酸实际上是四种脱氧核苷三磷酸，既是原料，也是能源。在PCR反应中加入的Mg2实际上是Taq聚合酶的激活剂。,(2012盐城高二检测)PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是()PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的,PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制ABC D【解析】PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为1540个核苷酸。PCR过程中，DNA解旋不依赖解
6、旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。,【答案】C【探规寻律】细胞内DNA复制与PCR技术的原理和过程容易发生混淆，特别应注意区分PCR反应需要可变的温度，而体内DNA复制需要稳定的温度。,1.有关PCR技术，下列叙述不正确的是()A聚合酶链式反应，是在体外扩增DNA片段的技术B在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似CPCR反应只需在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸,变式训练,DPCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸解析：选C。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种
7、脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。,2. PCR引物(1)引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链作引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。(2)引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR反应失败。,(3)引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。3.PCR扩增的过程,(1)变性：当温度上升到94 时，双链DNA解旋为单链，如下图：,(2)退火：温度下降至4060 左
8、右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：,(3)延伸：当温度上升至72 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：,4. PCR扩增数目的理论计算理论上DNA扩增呈指数增长，若只有一个DNA模板，则复制n次后有2n个DNA；若一开始有m个DNA模板，则复制n次后有m2n个DNA。实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说，实验值要略小于理论值。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，,并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序
9、列，使这段序列呈指数扩增。,近20年来，PCR技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。,(1)加热使DNA双链间的_键完全打开，称为_；而在细胞中是在_酶的作用下进行的。(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入_种特定的引物。当温度降低至56 时，引物与两条“舒展”的模板的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的_端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是_。,(3)PCR技术的必
10、需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的_和_，前者由_自动调控，后者则靠_来维持。(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是_。,【解析】(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为变性，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(94 )、退火(40 60 )、延伸(72 )，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距
11、离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3,端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。 (3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。(4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。,【答案】(1)氢 变性 解旋(2)两 3 从子链的5端向3端延伸(3)温度 酸碱度 PCR自动扩增仪 缓冲液 (4)1/8,互动探究(1)PCR中碱基错配会引
12、起哪种变异？(2)假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占多少？【提示】(1)基因突变。(2)50%。,变式训练2. (2012信阳高二质检)如图表示PCR扩增的产物，请分析它是哪次循环的产物()A第一次循环 B第二次循环C第三次循环 D第四次循环,解析：选A。在PCR反应中以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别与引物和引物结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以，形成的每个子代DNA中只有一种引物。从第二次循环开始，第一次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，形成的DNA
13、分子两端都含有引物。,【操作与实践】1.操作流程,目的DNA片段的体外扩增,2.注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。(2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。(4)EB是一种致癌物，在实验过程中要做好防护工作，如戴塑料膜防护手套；在紫外灯下观察时要戴上专用护眼镜！,【问题与探究】1.你明白PCR技术原理吗？【提示】在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似。PCR技术利用了DNA的热变性原理：在94 的高温下，作为模板的双链D
14、NA解旋成为单链DNA，当温度缓慢降低后，引物与模板的单链DNA的特定部位互补配对，再升高温度后，引物链延伸，形成互补的DNA双链。,2.你了解PCR反应的条件吗？【提示】(1)稳定的缓冲液环境。(2)DNA模板。(3)分别与模板DNA两条模板链相结合的两种引物。(4)A、T、G、C四种脱氧核苷酸。(5)耐热的DNA聚合酶，一般用Taq聚合酶。(6)能严格控制温度变化的温控设备。,3.如何判断DNA片段的扩增是否成功？【提示】(1)可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。(2)电泳检测法，可以通过在紫外灯下观察荧光带的多少来评价扩增的效果。,【例题】下列有关PCR技术的叙述，不正确的是()APCR技术是利用碱基互补配对的原则BPCR技术可用于基因诊断、判断亲缘关系等CPCR技术需在体内进行DPCR技术经过变性、退火、延伸三个阶段,【解析】PCR技术是聚合酶链式反应的简称，是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术。【答案】C,
