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1、1应用多重 PCR 技术检测慢性淋巴细胞白血病 IgVH基因突变作者：郑文娟陈丽娟吴雨洁李丽 徐卫 李建勇 【摘要 】 免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因突变是慢性淋巴细胞白血病(CLL)最重要的独立预后因素之一，为探讨 CLL 患者IgVH 基因突变状态，应用多重 PCR 技术检测 9 例 CLL 患者的IgVH 基因，纯化 PCR 扩增产物后直接测序，应用 IMGT/V-QUEST 工具分析，明确有无 IgVH 突变及突变位置。结果表明： 9 例 CLL 患者皆扩增出 395-465 bp 区域(MIX I)或 290-360 bp 区域(MIX II)单克隆条带，测序结果显示 5 例患
2、者有突变， IgVH 基因分别为 IGHV3-11*03、IGHV3-9*01、IGHV3-23*01、IGHV4-59*01 和 IGHV4-34*02；4 例无突变，IgVH 基因为 IGHV3-53*01、IGHV3-23*03、 IGHV3-33*05 和 IGHV3-7*01。结论： PCR 检测 IgVH 基因突变，简化了繁琐的实验过程，缩短了实验时间，解决传统 PCR 对 IgVH 基因突变检测的桎梏，值得在临床和科研中推广使用。 【关键词】 多重 PCR； IgVH； 基因突变2Detection of IgVH Mutation Status in Patients with
3、 Chronic Lymphocytic Leukemia by Multiplex PCRAbstract IgVH mutation status is one of the most important independent prognostic factor of chronic lymphocytic leukemia (CLL). In order to evaluate IgVH mutation status in patients with CLL, IgVH mutation was detected by multiplex PCR in 9 CLL patients
4、and purified PCR amplification products were directly sequenced, IgH somatic hypermutation and mutation site were analysed by IMGT/V-QUEST. The results showed that 5 patients had mutated IgVH, and IgVHs were IGHV3-11*03, IGHV3-9*01, IGHV3-23*01, IGHV4-59*01, IGHV4-34*02, respectively; whereas 4 othe
5、rs had unmutated IgVH, these IgVHs were IGHV3-53*01, IGHV3-23*03, IGHV3-33*05 and IGHV3-7*01. It is concluded that multiplex PCR is a rapid and easy method to detect IgVH mutation status, and it solves the limitations and pitfalls of routine PCR, and it is worth being extensively used both in clinic
6、 and scientific researches.Key wordsMultiplex PCR; IgVH; gene mutation3慢性淋巴细胞白血病(CLL)是西方国家最常见的一种恶性淋巴细胞增殖性疾病，约占全部成人白血病的 30%，主要发生在老年人，男女比例为 1.3-2.01。我国发病率虽然低于西方国家，但随着人口的老龄化，发病率呈现逐年上升趋势。CLL 患者的临床病程和转归呈高度异质性，部分患者生存同年龄、性别匹配的正常人相同，而部分患者即使接受了早期的积极治疗仍很快死亡1,2 。因此，CLL 预后因素的检测就显得尤为重要。近来多个研究组3-6证实，免疫球蛋白重链可变区(Ig
7、VH)基因突变是最重要的独立预后因素之一。本研究旨在应用多重 RT-PCR 技术研究 CLL 患者 IgVH 基因突变。材料和方法研究对象随机选取我院血液科住院或门诊的 CLL 患者，共 9 例，其中男 7 例，女 2 例，中位年龄 55 (36-77) 岁。临床分期应用 Binet分期，Binet A 期 2 例、 Binet B 期 5 例、 Binet C 期 2 例。所有患者行外周血常规、骨髓细胞形态学和多参数流式细胞术细胞免疫分型检测，诊断与分期均根据血液病诊断与疗效标准 7确定。实验室检查:外周血 WBC 数10109/L，淋巴细胞比例50% ，绝对值5109/L，骨髓增生活跃或明
8、显活跃，淋巴细胞数40%，4以成熟淋巴细胞为主；免疫表型： CD10-、CD19+、CD5+、CD23+、CD20+ 和 FMC7-，并排除其他疾病。收集患者的外周血或骨髓标本，用淋巴细胞分离液收集单个核细胞。IgVH 基因的多重 PCR 检测RNA 抽提及逆转录采取 TRIZOL 一步法抽提 RNA，并予以逆转录。逆转录反应体系： RNA 2 g，oligo dT 1 l (0.5 g/ l) ，5Buffer 8 l， dNTP (40 mmol/L) 2 l，AMV 10 U(1 l)，RNasin 40 U (1 l)， DTT (100 mmol/L) 1 l，加 DEPC 水至 4
9、0 l，70 , 10 分钟；冰上至少 10 分钟；42，1 小时；95 ，5分钟；冰浴 5 分钟，-80保存。PCR 引物 IgVH 片段由 3 个框架区(framework, FR)和两个抗原互补决定区(complementarity-determining regions, CDR)组成(图 1)。IgVH 基因引物由 InVivoScribe 公司提供(InVivoScribe, USA)，定购该公司编号为 5-1010010 的 IGH Somatic Hypermutation Assay for Gel Detection 试剂盒，其中有两种混合引物：MIX I 和 MIX II
10、，前者扩增领头区(leader) 和 JH 之间的基因，后者扩增 FR1 与 JH 间的基因。以 GAPDH 为内参照，上游引物： 3-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-5，下游引物： 3-5GAAGATGGTGATGGGATTTC-5，扩增片断为 230 bp。PCR 反应体系 MIX I 或 MIX II 45 l，Taq DNA 聚合酶 1 U (0.25 l)，cDNA 模板 5 l，共 50 l 反应体系。反应条件是： 94 7 分钟后， 94 45 秒；60 45 秒；72 90 秒扩增 35 个循环后，72 10 分钟。以相同条件扩增试剂盒中提供的阳性和阴性参照。2%的琼脂
11、糖凝胶电泳，紫外灯下观察到 7 例慢淋患者扩增出 395-465 bp 区域(MIX I)单克隆条带，2 例标本扩增出 290-360 bp 区域(MIX II)单克隆条带。PCR 产物序列分析未纯化 PCR 原液由上海生工纯化后直接测序。测序结果应用 IMGT/V-QUEST 数据库分析(http:/imgt.cines.fr)，明确有无 IgVH 突变及突变位置。 IgVH 碱基突变率=错配碱基数可变区总碱基数，IgVH 碱基突变率2%定为体细胞突变标准4,5 。结果9 份标本皆先用 MIX I 行扩增，其中 7 个扩增出 395-465 bp 区域的单克隆条带( 标本号为 1、2、4 、
12、5、7 、8、9)，3 号和 6号标本未扩增出特异性条带，再用 MIX II 扩增，扩增体系和反应条件同 MI，结果扩增出 290-360 bp 区域的单克隆条带(图 2)。测6序结果应用 IMGT/V-QUEST 数据库分析( 图 3)。5 例患者有体细胞突变，3 例处于 Binet B 期，2 例处于 Binet C 期，IgVH 基因分别为 IGHV3-11*03、IGHV3-9*01、IGHV3-23*01、IGHV4-59*01和 IGHV4-34*02；4 例无突变，2 例 Binet A 期，2 例 Binet B 期，IgVH 基因分别为 IGHV3-53*01、IGHV3-2
13、3*03、IGHV3-33*05和 IGHV3-7*01。IgVH 突变分析见表 1。 Table . IgVH mutation status analysis of 9 CLL patients（略）讨论CLL 是淋巴细胞克隆性增殖为特征的高度异质性恶性血液系统疾病。其预后的异质性使得 CLL 预后因素的检测就显得尤为重要，其中有无 IgVH 基因体细胞突变已被证实是目前为止与预后相关最为密切的因素。CLL 根据有无 IgVH 基因体细胞突变分成两种类型。无 IgVH 基因突变型：起源于生发中心前 B 细胞，为生发中心前期肿瘤，病情展快、生存期短，临床分期多为晚期；IgVH 基因突变型：起
14、源于记忆 B 细胞，为生发中心后期肿瘤，病程展缓慢，生存期很长，临床分期多在早期3,6 。本组 9 例患者，4 例无 IgVH基因突变患者 2 例处于 Binet A 期，2 例处于 Binet B 期；5 例IgVH 基因突变型患者 3 例处于 Binet B 期、2 例 Binet 处于 C 期。但 9 例患者至今皆只随访 2 年左右，病情尚无变化。由于随访时间短，病例数少，IgVH 突变情况无法与分期形成有效统计，这有待于我们在今后的研究中一步增加病例数，延长随访时间，观察疾病7展情况以作出准确判断。正常和恶性 B 细胞中最常见的 VH 家族是 VH3(30%-50%)和 VH4(20%
15、-30%)，其次是 VH1(10%-20%)家族，占总数的 75%-95%；在 Precursor B-ALL 中 VH6 也多见8 。本研究中 9 例标本的 IgVH 基因有 7 例属于 VH3，2 例属于 VH4，与报道相符。但 Tobin 等9 报道，IgVH 基因突变型患者以VH3-21 多见，无 IgVH 基因突变型患者以 VH1-69 多见。但本组9 例标本均未见以上两种 IgVH 基因类型。每一个 B 细胞都有自己长度和序列特异的由可变区(V)、多变区(D)和结合区(J)片段重排形成的位于 14q32、大约 1250 bp IgH 基因。IgH 基因包括 7 个 VH家族(现已发
16、现 52 个有功能的 VH 片段，30 个无功能的 VH 片段)、7 个 DH 家族 (现已发现 27 个有功能的 DH 片段)、6 个 JH 家族(现已发现 6 个有功能的 JH 片段)。不同 V、D 、J 区的排列组合大约有2106，而基因重组过程中的核苷酸的随机缺失和插入，使得排列组合的数目剧增，超过至1012。淋巴细胞的 Ig 分子要经过生发中心的体细胞高度突变才能成为成熟的 B 细胞(因此生发中心或生发中心后期起源的成熟的 B 细胞恶性肿瘤中存在有体细胞突变)，而这一过程同时扩大了 Ig 排列组合的数目8,10 。IgVH 基因片段中FR 序列相对保守，而 CDR 即使在同一 VH 家族中也高度不同，是生发中心期体细胞突变的高发区，尽管 FR 不易发生体细胞突变，但可发生核苷酸置换，尤其易发生在高度突变的 B 细胞。现在在一些实验室开展的 PCR 技术检测 Ig
