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1、1川穹嗪对大鼠心肌肥大 JAKSTAT 通路作用【摘要】 目的 了解川穹嗪对大鼠心肌肥大 JAKSTAT 通路的影响。方法 建立心肌肥大动物模型，40 只大鼠随机分为 4 组，每组 10只，分别为血管紧张素(Ang)组( 给予 Ang 36 mgkg-1d-1)、Ang加川穹嗪组(给予 Ang 36 mgkg-1d-1，川穹嗪 50 mgkg-1d-1)、Ang加 PBS 组(给予 Ang 36 mgkg-1d-1，PBS 50 mgkg-1d-1)、对照组(给予生理盐水 36 mgkg-1d-1)，计算心肌肥大指数。培养、鉴定新生大鼠心肌细胞，每天分别给予Ang 110-7 mol/L(An
2、g2 组)、Ang 110-7 mol/L+川穹嗪 110-4 mol/L(Ang 加川穹嗪 2 组) ，以不加药物作为对照 2 组，培养 7 d，应用 RTPCR 方法检测各组大鼠心肌细胞心房利钠肽(ANP)相对水平，Westernblot 检测心肌肥大信号转导途径分子pJAK2、pJAK1、pSTAT3 表达。结果 Ang组与对照组比较，心肌肥大指数明显增高，差异有统计学意义(F=32.675,q=6.25，P0.01) ，Ang+川穹嗪组与 Ang组相比较，心肌肥大指数明显下降，差异有显著意义(q=5.19，P0.05)。Ang2 组与对照 2 组比较，ANP mRNA表达增加，差异有显
3、著性(F=45.674,q=11.23，P0.01);Ang+川穹嗪 2 组与 Ang2 组比较，ANP mRNA 表达减少，差异有显著性(q=7.53，P0.01)。Ang2 组加入川穹嗪前后pJAK1、pJAK2、pSTAT 蛋白表达量比较，差异有显著性2(F=24.45636.549，q=8.02 10.25 ，P0.05、0.01)。 结论 川穹嗪能通过干扰心肌肥大 JAKSTAT 信号转导通路抑制心肌肥大。【关键词】 肌细胞,心脏;肥大; 血管紧张素 ; 信号传导;川穹嗪 ABSTRACT Objective To study the effect of Tetramethylpyr
4、azine (TMZ) on JAKSTAT signal transduction in rats with cardiomyocyte hypertrophy. Methods A cardiomyocyte hypertrophy (CH) model was made in 40 Wistar rats, which wereequally randomized to four groups. The first group was given Ang 36 mgkg-1d-1; the second, Ang 36 mgkg-1d-1 and TMZ 50 mgkg-1d-1; th
5、e third, Ang 36 mgkg-1d-1 and PBS 50 mgkg-1d-1; and the control, saline 36 mgkg-1d-1. Myocardial hypertrophy index (MHI) was calculated. Newborn cardiocytes in rats were caltured for seven days and identified. The first group was given Ang 110-7 mol/L; the second, Ang 110-7 mol/L and TMZ 110-4 mol/L
6、; and the control, no medicine given. The relative level of of atrial natriuretic peptide was detected by RTPCR, and pJAK2, pJAK1 and pSTAT3 molecules analysed by Westenblot. Results Compared with the control, the MHI in Ang group was significantly increased (F=32.675,q=6.25,P0.01); compared with An
7、g+TMZ 3group, the MHI in Anggroup decreased (q= 5.19,P0.05); compared with the control2, the expression of ANP mRNA in Ang increased (F=45.674,q=11.23,P0.01); compared with Anggroup, the expression of ANP mRNA in Ang plus SMZ group decreased (q=7.53,P0.01). The differences of the expressions of pJAK
8、1, pJAK2 and pSTA in Anggroup,before and after SMZ aided, were significant (F=24.456-36.549;q=8.02-10.25;P0.05, 0.01). Conclusion TMZ could inhibit the cardiomyocyte hypertrophy by interfering JAKSTAT signal transduction. KEY WORDS Myocytes, cardiac; Hypertrophy; Angiotensin ; Signal transduction; T
9、etramethylpyrazine 心肌肥大是血流动力学负荷增加使心脏产生的长期反应，涉及到以心肌细胞体积增大为特征的重塑过程，是启动心力衰竭一个病理过程1。近年来研究显示，有许多信号通路在心肌肥大和心力衰竭过程中起重要作用，其中 JAKSTAT 通路在心脏疾病发病机制中的作用倍受关注2。人们对这一通路进行的研究显示，许多细胞因子及非免疫性生物化学递质都能激活 JAKSTAT 信号通路，从而启动相应的基因转录直接激活心肌肥大(代偿性)和细胞生存相关基因3。天然四甲基吡嗪又名川穹嗪, 为中药川穹的主要有效成分,具有改善心功能和血流动力学功能作用4。川穹嗪治疗心血管病方面研究目前仅限制在细胞水平
10、，本文研究川穹嗪与心肌肥大4JAKSTAT 通路之间的联系，现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料 成年 Wistar 大鼠 40 只，雌雄不拘，体质量为 200250 g;新生 Wistar 大鼠 2 只，由青岛大学医学院动物部提供。川穹嗪粉末购自无锡第七制药厂，溶于 PBS。血管紧张素 (Ang)购自 SigmaAldrich (Saint Louis)。DMEM/F12 细胞培养基购自Gibco 公司;小牛血清(BS)购自杭州四季青生物制品有限公司 ;抗体：兔抗人磷酸化 JAK/STAT 一抗购自美国 Santa Cruz 公司;HRP 偶联或荧光二抗购自 Amersham 公
11、司(Buckinghamshire, UK)。本文所用引物均由上海 Sangon 公司合成。PCR 引物序列为：ANP 正义链：5GGCTCCTTCTCCAT2CACCAA3, 反义链： 5TGTTATCTTCGGTACCG3,产物大小 458 bp。总 RNA 抽提试剂 Trizol 购自 Gibco BRL 公司，RTPCR 试剂盒购自 Promega 公司。 1.2 方法 1.2.1 建立心肌肥大动物模型 将 40 只成年 Wistar 大鼠随机分为 4 组，每组各 10 只，分别为血管紧张素(Ang)组(渗透性小泵皮下注射 Ang 36 mgkg-1d-1)、Ang加川穹嗪组( 皮下注
12、射 Ang 36 mgkg-1d-1，口服川穹嗪 50 mgkg-1d-1)、Ang加 PBS 组(皮下注射 Ang36 mgkg-1d-1，口服 PBS 50 mgkg-1d-1)及对照组( 渗透性小泵皮下注射生理盐水 36 mgkg-51d-1)，共 4 周。 1.2.2 心肌肥大动物模型的鉴定 实验结束，动物称质量后，迅速打开胸腔，取出心脏，放入冰生理盐水中，去除杂质及脂肪，分离左心室，分析天平称质量，计算心肌肥大指数。心肌肥大指数=左心室质量(LVW)/ 体质量 (BW)5。 1.2.3 心肌细胞培养与鉴定 取新生 Wistar 乳鼠心室肌，用胰蛋白酶消化法消化成单细胞悬液，经差速贴壁
13、分离后，将未贴壁心肌细胞用含体积分数 0.15 胎牛血清及青链霉素的 DMEM 培养液稀释，并加入 0.1 mol/L BRDU 以抑制非心肌细胞的增殖，然后将细胞均匀地接种于 25 mL 培养瓶中，置于 37 , 含体积分数 0.05 CO2 培养箱中培养 2 d，弃原液，用无血清 DMEM 液洗 2 次，用含体积分数 0.15 胎牛血清的 DMEM 培养 2 d。分为 4 组，各 10例。对照 2 组：加入培养液 5 mL;Ang2 组：加入 Ang 0.5 g，培养液 5 mL，Ang终浓度为 110-7 mol/L; Ang加川穹嗪 2 组：分别加入 Ang 0.5 g，川穹嗪 64
14、g，培养液 5 mL，Ang终浓度为 110-7 mol/L，川穹嗪终浓度为 110-4 mol/L。每 24 h 加药 1 次，每 48 h 换液 1 次，于加药后第 7 天收集心肌细胞，提取总 RNA。 1.2.4 RTPCR 检测心肌细胞 ANP mRNA 表达水平 用预冷的无菌 PBS 清洗待测细胞 2 次;吸干残液后，按 1 mL/cm2 加Trizol 液裂解细胞; 将细胞裂解液移至 2 mL 离心管中，室温下静置5 min;细胞裂解液中提取细胞总 RNA;RNA 沉淀干燥后，用 20 L 6DEPC 溶解。 取 1 L RNA 溶液，稀释，经紫外线分光光度仪检测其波长 260 n
15、m 及 280 nm 处吸光度，估算其 RNA 浓度6 。逆转录合成 cDNA， PCR 扩增后，取 10 L PCR 反应产物在 15 g/L 的琼脂糖凝胶上电泳，透射紫外线灯下观察，拍照，用凝胶成像系统进行扩增产物定量分析,用待测基因 ANP/GAPDH 值表示待测基因ANP 相对水平。 1.2.5 Western blot 方法检测川穹嗪对 Ang致培养心肌细胞 pJAK 蛋白 15 min、 pSTAT 蛋白 5 min 7的影响 按文献8 的方法制作蛋白标准曲线，测出待测蛋白样本的吸光度(A)值。抽提细胞总蛋白：细胞长至瓶底的 80%90%时，弃去培养液，用预冷的PBS 洗涤 2 次，沥干;向培养瓶中加入相应体积的蛋白裂解液，冰浴520 min;使用刮棒刮下细胞，收集到预冷的 1.5 mL 离心管中，4 下以 12 000 r/min 离心 20 min，取上清分装，保存于-70 ;根据标准曲线测量蛋白浓度。Western blot 检测：取等量pJAK、pSTAT 蛋白(100 g)与上样缓冲液混合，变性后上样，电泳，转膜，封闭，洗涤，用封闭液将 JAK/STAT 的一抗( 兔抗)浓度调整至 11 000， 4 与膜孵育过夜;洗涤;二抗用封闭液按 15 000 稀释，室温孵育 1 h;洗涤; 加底物显色剂，暗室中进行显色。增强化学发光法检测显色蛋白质含量
