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1、1山茶种子对乏营养状态下胰腺癌细胞耐受性消除作用的研究作者：史丽颖, 唐玲, 吴小娟, 林红景, 冯宝民 , 王永奇【摘要 】 目的探讨山茶种子对乏营养状态下胰腺癌细胞耐受性的消除作用。方法使用山茶种子的不同提取物, 分别作用于有营养状态下的胰腺癌细胞和乏营养状态下的胰腺癌细胞。用 cell counting kit-8 (CCK-8) 活细胞计数法检测样品对胰腺癌细胞存活率的影响。结果山茶种子醇提物醋酸乙酯层能优先在乏营养状态下有效消除胰腺癌细胞的耐受性, 在 50 g/ml 的浓度下，胰腺癌细胞的存活率仅为 1.4%。结论山茶种子醇提物醋酸乙酯层能优先在乏营养状态下杀死胰腺癌细胞, 提示其
2、在胰腺癌治疗上可能有一定的应用前景。 【关键词】 山茶 胰腺癌 癌细胞耐受性Abstract：ObjectiveTo explore the ability of the seed of Camellia semiserrata Chi to eliminate the tolerance of pancreatic cancer cells to nutrient starvation. MethodsThe extracts of the seed of C. semiserrata Chi were used to treat the pancreatic cancer cells un
3、der the nutrient-deprived 2condition and nutrient-rich condition. The effect of treatment with various samples on survival rate of pancreatic cancer cell was examined with cell counting kit-8 (CCK-8). ResultsEtOAc fraction of the EtOH extract from the seed of C. semiserrata Chi exhibited strong abil
4、ity to eliminate the tolerance of the pancreatic cancer cell to nutrient starvation. The survival rate of pancreatic cancer cells was 1.4% at a concentration of 50 g/ml. ConclusionEtOAc fraction of the EtOH extract from the seed of C. semiserrata Chi was found to kill PANC-1 cancer cells preferentia
5、lly under nutrition starvation. It may be useful for pancreatic cancer therapy.Key words：Camellia semiserrata Chi; Pancreatic cancer; Tolerance of cancer cells胰腺癌 (Pancreatic cancer) 是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，近年来在世界范围内其发病率呈现出明显上升的趋势。由于发病隐袭和高度进展性，胰腺癌早期诊断十分困难，大多数患者在确诊时已达局部晚期或发生远处转移，治疗棘手，死亡率极高。因此必须积极应用化疗、放疗、生物治疗
6、等综合手段，提高手术后长期生存率。近年来，胰腺癌的药物治疗已经有了显著的进步，尤其是化疗已经成为必不可少的治疗手段之一1 。3临床上血管造影术显示人类的癌经常是少血供、缺氧状态的肿瘤组织与极度恶性的癌相关。对此一个可能性的解释就是癌在发展过程中缺氧状态迫使肿瘤去获得血管再生，同时肿瘤也获得了耐受乏营养状态的能力，这也是恶性肿瘤的另外一个关键特征。如预期的一样，PANC-1 胰腺癌细胞系，一个少血供肿瘤的典型代表，已经被发现耐受葡萄糖缺乏。既然生理反应所调控血流供应给正常组织，因而慢性缺血不应该出现在正常组织，所以 Esumi 等人设想消弱肿瘤对乏营养状态的耐受性将是癌症治疗方案的一个新目标24
7、 。山茶 Camellia semiserrata Chi 属于山茶属 Camellia Linn. 植物，主产于我国西南部和东南部，在对广西药用资源调查研究的基础上，我们发现在以往的文献报道中山茶在抗癌方面有一定的活性5 ，进而我们对山茶的抗胰腺癌活性进行了研究。 基于Esumi 等人的假设，我们检测了山茶种子提取物对胰腺癌细胞的乏营养状态耐受性的消除作用。1 材料与方法1.1 生药材山茶种子采集于广西巴马地区，由辽宁师范大学陈辰教授鉴定。41.2 细胞系和培养液人胰腺癌细胞系 PANC-1 从 American Type Culture Collection 获得，培养于含有 10%小牛血
8、清，2% L-谷氨酰胺，1% 青霉素和 1%链霉素的 DMEM (日本日水制药株式会社) 培养液中。乏营养培养基由 265 mg/L CaCl2(2H2O), 0.1 mg/L Fe(NO3)2(9H2O), 400 mg/L KCl, 200 mg/L MgSO4(7H2O), 6 400 mg/L NaCl, 700 mg/L NaHCO3, 125 mg/L NaH2PO4, 15 mg/L 酚红，25 mmol/L HEPES 缓冲液和MEM 维生素液，最终以 10% NaHCO3 调 pH 至 7.46，7 。1.3 在乏营养状态下的细胞毒作用将 PANC-1 胰腺癌细胞种于 96
9、孔培养板，每个孔细胞数为 1104。培养于 DMEM 培养液中，在 37，5% CO2 条件下培养 24 h。培养 24 h 后，以 PBS冲洗细胞，加入新的 DMEM 培养液或乏营养条件的培养液，然后立即加入系列浓度的待测样品。培养 24 h 后，再次用 PBS 冲洗细胞，然后加入含有 10% 活细胞计数试剂 CCK-8 的 DMEM 培养液100 l，继续培养 2 h，然后在 450 nm 波长下测定每个孔的吸光度值6，7 。因为吸光度值与培养液中活细胞数成正比，所以通过吸光度值可以计算细胞存活百分率。2 结果5用浓度分别为 50 g/ml 和 100 g/ml 的山茶种子的不同提取物处理
10、 PANC-1 人胰腺癌细胞，每个样品分别作用于有营养状态和乏营养状态下的 PANC-1 胰腺癌细胞。结果发现山茶种子醇提物能消除 PANC-1 胰腺癌细胞对乏营养状态的耐受性。经山茶种子醇提物在浓度分别为 50 g/ml 和 100 g/ml 处理后，在乏营养状态下 PANC-1 胰腺癌细胞的存活率分别为 20.6%和 0%，而在有营养状态下细胞仍然全部存活 (表 1)。此外，山茶种子醇提物醋酸乙酯层和醇提物过 D101 大孔树脂 40% EtOH-H2O 洗脱部分也能有效消除 PANC-1 胰腺癌细胞对乏营养状态的耐受性。山茶种子醇提物醋酸乙酯层，在 50 g/ml 浓度下处理细胞，在乏营
11、养状态下细胞的存活率仅为 1.4%，在有营养状态下细胞几乎全部存活，但在 100 g/ml 浓度下处理细胞，在乏营养状态下细胞的存活率为 0%，在有营养状态下细胞却也有部分死亡，存活率为 76.9%。山茶种子醇提物过 D101 大孔树脂 40% EtOH-H2O 洗脱部分在 50 g/ml 和100 g/ml 浓度下处理细胞，在乏营养状态下细胞的存活率为 9.6%和0%，在有营养状态下细胞几乎全部存活 (表 1)。表 1 山茶种子不同提取物对乏营养状态下胰腺癌细胞耐受性的消除作用（略）3 讨论肿瘤生长和增殖很大程度上依赖于血管新生来实现功能性的血流供应。然而，尽管大量的血管新生，肿瘤内的细胞仍
12、处于氧气和营养匮乏的状态，部分是由于他们比正常的内皮细胞增殖还要快，6部分是由于新形成的血管网络是紊乱的，因此不具备理想的功能8，9 。然而，肿瘤细胞具有一种固有的生存能力，即便是在极端的条件下，特别是在低氧气和营养供应的条件下10,12 。这对于高侵袭性肿瘤，如胰腺癌，这个相对少血供肿瘤，是个特别有说服力的解释13 。而问题是胰腺癌细胞在极度乏氧和营养匮乏的条件下是如何生存和增殖的，这一定有一些机制帮助胰腺癌细胞在这样极端不利的环境中生存和增殖。因此根据 Awale 等前期工作，假定对乏营养状态的耐受性是对少血流供应的生物反应的一部分，因而以乏营养状态下的癌细胞为对象，可能是抗癌药物研究的一
13、个新手段6，7 ，14 。基于以上理论，我们采用乏营养状态下抗癌药物筛选的新方法，对山茶种子的不同提取物的抗胰腺癌活性进行了筛选。我们发现山茶种子醇提物在 100 g/ml 的浓度下能有效消除 PANC-1 胰腺癌细胞对乏营养状态的耐受性，其存活率为 0%，而在有营养状态下细胞仍然全部存活。因为正常组织不出现慢性缺血，所以在有营养状态下经样品处理后细胞仍然全部存活，说明其对正常组织没有细胞毒作用，而能选择性杀伤癌细胞。山茶种子醇提物醋酸乙酯层在 50 g/ml 的浓度下，能优先在乏营养状态下有效消除胰腺癌细胞的耐受性，胰腺癌细胞的存活率仅为 1.4%，在 100 g/ml 的浓度下，在乏营养状
14、态下显示了较强的细胞毒作用，但其在有营养7状态下也显示了部分细胞毒作用。山茶种子醇提物过 D101 大孔树脂 40% EtOH-H2O 洗脱部分能有效消除 PANC-1 胰腺癌细胞对乏营养状态的耐受性而在有营养状态下细胞几乎全部存活。以上结果表明在 50 g/ml 的浓度下，山茶种子醇提物醋酸乙酯层能优先在乏营养状态下杀死胰腺癌细胞，并且活性最强，提示其在胰腺癌的治疗上可能有一定的应用前景。【参考文献】1龚新雷, 秦叔逵. 胰腺癌的药物治疗进展 J. 临床肿瘤学杂志, 2007, 12 (1): 68.2Esumi H, Izuishi K, Kato K, et al. Hypoxia an
15、d nitric oxide treatment confer tolerance to glucose starvation in a 5-AMP-activated protein kinase-dependent manner J. J Biol Chem, 2002, 277: 32791.3Hockel M, Vaupel P. Biological consequences of tumor hypoxia J . Semin Oncol, 2001, 28: 36.4Izuishi K, Kato K, Ogura T, et al. Remarkable tolerance o
16、f tumor cells to nutrient deprivation: possible new biochemical target for cancer therapy J. Cancer Res, 2000, 860: 6201.5王永奇, 吴小娟, 李红冰, 等. 药用山茶属植物的研究J. 大连大学学报, 2006, 27 (4): 47.6Awale S, Lu J, Kalauni SK, et al. Identification of arctigenin as an antitumor agent having the ability to eliminate the tolerance of cancer cells to nutrient starvation J. Cancer Res, 2006, 66 (3):1751.7 Awale S
