《屋尘螨cDNA表达文库的构建及初步鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《屋尘螨cDNA表达文库的构建及初步鉴定（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1屋尘螨 cDNA 表达文库的构建及初步鉴定作者：刘良，彭江龙，周鹰，崔玉宝【摘要 】 目的： 构建屋尘螨 cDNA 表达文库. 方法： 用RNAiso Reagent 试剂盒提取屋尘螨 Total RNA，用 Poly AT tract mRNA 分离试剂盒提取 mRNA，用 Clontech 公司 SMARTTM PCR cDNA library kit 反转录合成第 1 链 cDNA，用 LDPCR 合成第 2 链 cDNA 并扩增，PCR 产物与 MaxPlax TM 试剂盒体外连接包装，建成未扩增的 cDNA 文库，计算其滴度和重组效率后进行文库扩增并测定扩增文库的滴度. 结果： c
2、DNA 文库未扩增时滴度为9.148106，重组效率达 93.88%以上，文库扩增后滴度为7.628109，插入片段平均 1.63 kb. 结论： 成功地构建了高质量的屋尘螨 cDNA 表达文库 . 【关键词】 欧洲屋尘螨，基因文库0 引言随着现代分子生物学技术的发展，应用基因工程变应原诊断2和治疗变态反应性疾病已成为当代变态反应学研究的主流. 研究表明，基因工程技术通过减少重组变应原 IgE 结合的抗原表位，能有效地降低 IgE 介导的过敏反应，同时通过保留变应原 T 细胞识别所必须的结构域，因而具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，可以提高脱敏治疗的效果1-2.制备基因工程变应原的前提
3、是获取目的基因. 从理论上讲，研究者可从一个合格的基因文库中调取任何目的基因，是发现并获取特异性基因克隆应用于重组变应原研究的有效方法之一. 本研究采用 Clontech 公司 Smart 方法构建屋尘螨 cDNA 表达文库，为系统地研究屋尘螨的基因结构和功能、进一步制备尘螨基因工程变应原奠定基础.1 材料和方法1.1 材料 SMARTTM PCR cDNA library kit 为美国 Clontech 公司产品，RNAiso Reagent， Transcript RNA Clean Up Kit 均购自日本 TaKaRa 公司，poly AT tract mRNA 分离试剂盒由美国Pr
4、omega 公司生产. OligodT 纤维素、 MMLV 反转录酶和MaxPlaxTMLambda Packaging Extract 购自德国 Eicentre technologies 公司，其余试剂为国产分析纯 . TP3000 PCR 仪（Takara） ，Mupid 电泳仪(Advancebio Co., Ltd)，3ImageMaster VDS 电泳成像装置（Pharmacia Biotech） ，ABI PrismTM 377XL DNA Sequencer DNA 测序仪（Perkin Elmer）.1.2 方法1.2.1cDNA 文库的构建解剖镜下挑取屋尘螨约 200 只
5、，匀浆后用 TaKaRa RNAiso Reagent 试剂盒提取 Total RNA，用 Poly AT tract mRNA 分离试剂盒提取 mRNA，操作按说明书进行. 参照试剂盒说明书，cDNA 文库的构建以 mRNA 为模板，Smart Oligonucleotid (dT)为引物，在 MMLV 反转录酶作用下合成cDNA 第 1 链；加入 dNTPs，5 PCR Primer，3 PCR Primer和 Advantage 聚合酶，置基因扩增仪上用长距离 PCR(LDPCR)合成得双链 DNA，取 PCR 产物 5 L 用琼脂糖凝胶电泳检测，以鉴定双链 DNA 分布范围. 经蛋白酶
6、 K 灭活、Sfi酶切、过柱 (Chro2Maspin 400) 分级分离后，连续收集 12 个单滴组分，每组分取 2 L 进行琼脂糖凝胶电泳，收集前 4 个含有 cDNA 的组分，用乙醇沉淀回收. 按照 cDNAVector = 12/11/21 三种方式进行连接，用 MaxPlaxTM 试剂盒对连接产物进行体外包装，至此建屋尘螨 cDNA 未扩增文库 .1.2.2 未扩增文库滴度测定取 3 种连接方式稀释度为15，110 和 120 的包装产物各 1 L，分别与过夜液体培养物4200 L 混合，并加入融化的 LB/MgSO4 Top Agar 3 mL，快速倒在 37预热的 90 mm L
7、B/MgSO4 平板，快速旋转平板，使 Top Agar 水平分布，室温冷却 10 min 后置 37倒置培养 618 h. 统计噬菌斑，计算滴度 pfu/mL=噬菌斑数稀释因子103/铺板体积(L). 利用 IPTG 和 XGal 诱导上述未扩增文库计数蓝、白斑，重组效率=白斑数/(白斑数+蓝斑数).1.2.3 扩增文库滴度计算在 10 mL 试管中加入过夜培养的XL1Blue 菌液 500 L 和足够的噬菌体液(未扩增文库)，在 37 水浴 15 min 后，每管加入融化的 LB/MgSO4 Top Agar 9 mL，快速混匀铺板，室温冷却后置 37倒置培养至噬菌斑长满，每块平板加入 1
8、 稀释液 12 mL，4 过夜，以得到已扩增文库的裂解液；将平板在脱色摇台上室温 50 r/min 1 h，用灭菌烧杯收集平板中的噬菌体裂解液，充分混匀后分装于 50 mL 灭菌离心管，每管加入氯仿10 mL，盖紧，振荡混匀 2 min，7000 r/min 离心 10 min，收集上清液，4保存. 扩增文库滴度计算方法同上，所选用的噬菌体裂解液稀释度为 10-4，铺板体积为 5 L/12 mm.1.2.4 文库的 PCR 鉴定随机挑取 12 个单克隆噬菌斑分别加入到装有 100 L 1 稀释缓冲液的管中，并加入 XL1Blue 菌的过夜培养物 200 L，制备 DNA 模板. 根据克隆位点两
9、端的序列设计并委托上海生物工程公司合成引物5P1(5CTCCGAGATCTGGACGAGC3)和引物 P2 (5TAATACGACTCACTATAGGG3). PCR 反应体积为 50 L，具体如下：DNA 模板 6 L，引物 P1 和 P2 各 1 L (10 mol/L)，10Advantage 2 PCR Buffer 5 L，10 mmol/L dNTP Mix 2 L，50Advantage 2 Polymerase Mix 及 ddH2O 34.6 L. 反应条件：95预变性 1 min，95 50 s，56 50 s，72 1 min，共 35 个循环，最后 72维持 10 mi
10、n. PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定.取灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管，每管加文库裂解液 1 mL 及DMSO 70 L，混匀，并做好标记、封口，-80保存文库.2 结果2.1cDNA 文库的构建按 Takara 公司 RNAiso Reagent 说明书操作获得屋尘螨总 RNA 30 L，紫外分光光度计测定核酸含量 0.62 g/L， A260/A280=1.87，12 g/L 琼脂糖凝胶电泳结果显示 18 s 和28 s 两条带，未见降解(图 1)，提示获得的总 RNA 纯度高. 用 Poly AT tract mRNA 分离试剂盒提取 mRNA 后，以 mRNA 为模板，
11、Smart Oligonucleotid (dT)为引物，在 MMLV 反转录酶作用下合成 cDNA 第 1 链，电泳显示第 1 链 cDNA 大部分集中在 0.52 kb 之间，符合 cDNA 合成的分布规律( 图 2). LDPCR 合成得双链6DNA，取产物 5 L 用琼脂糖凝胶电泳检测，合成的双链 cDNA 稍大于第 1 链，大部分集中在 0.5 kb 以上（图 3）.12: 屋尘螨总 RNA.图 1 屋尘螨总 RNA 电泳图1: 屋尘螨 cDNA 第 1 链; M: DNA Marker DL2000.图 2 屋尘螨 mRNA 反转录合成的 cDNA 第 1 链2.2 未扩增文库滴度
12、计算噬菌斑数结果表明以第 2 种连接方式所产生的噬菌斑数最多，第 3 种连接方式次之，第 1 种连接方式最少，说明第 2 种连接方式效果最好（表 1）. 取 3 种连接的最小值计算每种连接的滴度，pfu/L=(2.21+16.875+8.36)0.5109/(0.5+0.5+0.5) =9.148109 pfu/L. 重组效率的计算表明，3 种连接方式的重组效率 (94.77%, 97.66%, 93.88%)均高于 80%，满足构建质量文库的需要.M: DNA Marker DL2000;1: 屋尘螨 cDNA 第 2 链.图 3 屋尘螨 mRNA 反转录合成的 cDNA 第 2 链 表 1
13、3 种连接方式在 3 种稀释度时的噬菌斑数72.3 扩增文库的滴度稀释度为 10-5 的 3 个平板内噬菌板最为清晰可数，以此计算扩增文库滴度，pfu/L= (462/5+637/10+1455/20)/31085103=7.6281012 （表2）. 表 2 稀释度为 10-5 的 3 个平板计算结果2.4 文库的 PCR 鉴定根据载体克隆位点两端的序列设计引物进行PCR 鉴定，结果显示，所选的 12 个噬菌体均含有重组 cDNA，长度在 400 bp 以上的有 2 个，500 bp 左右的有 2 个，750 bp 以上的有 2 个，1000 bp 以上的有 2 个，2000 bp 及其以上
14、的有 4 个，平均 1.63 kb(图 4).3 讨论尘螨隶属于节肢动物门(Arthropoda) 、蛛形纲(Arachnida) 、蜱螨亚纲(Acari)，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具较强的M: DNA Marker DL2000;112: 含重组 cDNA 的噬菌体 PCR产物.图 4 屋尘螨 cDNA 文库的 PCR 鉴定8变应原性，可引起螨性哮喘、异位性皮炎、过敏性鼻炎等型变态反应性疾病. 法国 N. Roche(2000)估计约 60%100%的哮喘患者对尘螨过敏3. 国内学者用粉尘螨浸液对哮喘患者进行皮肤挑刺试验，47%92.11% 的成人患者呈阳性反
15、应，51.64%78.85%患儿对尘螨过敏4 . 哮喘全球防治策略指出，哮喘每年造成的直接或间接损失达 100 亿美元5 . 随着工业化的发展，人民生活水平的提高，此类疾病的发生不但不下降反而呈上升趋势6.特异性免疫治疗被认为是目前唯一型变态反应性疾病病因治疗方法，即通过逐渐增加、反复皮下注射特异性变应原，提高患者对特异性变应原的免疫耐受力，调节患者细胞免疫功能，增强Th1 反应,抑制 Th2 反应，并产生高水平的 IgG 抗体阻断变应原结合到 IgE，以提高患者对特异性变应原的免疫耐受力，达到再次暴露于特异性变应原后不发病或虽发病、但症状明显减轻的目的1-2,7-9.尘螨变应原成份复杂，约有
16、 30 余种，现已提纯出 16 类变应原. 目前，临床主要采用尘螨变应原粗提浸液免疫治疗哮喘患者，由于变应原浸液包含成分较复杂，如存在变应原、非过敏性或毒性蛋白及其他成分，所以很难进行变应原标准化，且在治疗中长期使用易导致严重 IgE 介导的过敏反应，如可发生红晕、肿胀、硬结、9坏死等局部反应和休克、喉头水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应1-2,7-9 ，因此，提高变应原纯度是减少免疫治疗副反应发生的有效途径. 1998 年，WHO 发布的关于免疫治疗的指导文件中强调，变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫治疗的变应原应该是纯品而不宜为粗制浸液7. 但是，尘螨变应原主要存在于螨的排泄物和皮壳中，采用生物化学方法提纯尘螨变应原，
