《呼吸道合胞病毒感染启动气道重塑的机制研究（毕业设计-儿科学专业）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《呼吸道合胞病毒感染启动气道重塑的机制研究（毕业设计-儿科学专业）（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 广州医学院硕士学位论文呼吸道合胞病毒感染启动气道重塑的机制研究姓名：王金华申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：陈爱欢20100601 广州医学院硕士论文- 中文摘要呼吸道合胞病毒感染启动气道重塑的机制研究专 业：儿科学研究生：王金华师：陈爱欢教授导中文摘要研究背景：呼吸道合胞病毒（RSV）是引起婴幼儿呼吸道感染最重要的病毒，几乎所有婴幼儿在生后头二年都感染过 RSV。RSV 下呼吸道感染（RSV-LRTI）是诱发婴幼儿第一次喘息和导致婴幼儿住院最常见的原因，临床观察和研究也发现，婴幼儿急性 RSV-LRTI后常发生反应性气道疾病（RAD），在急性期过后的相当长时间内出现反复喘息发作，且目
2、前发现，婴幼儿期 RSV-LRTI与哮喘发病密切相关，可明显增加日后慢性持续性哮喘的发生。有关儿童早期 RSV-LRTI增加日后慢性持续性哮喘发生的机制尚不明确，推测可能是易感个体在呼吸系统处于快速发育成熟阶段的儿童早期发生 RSV-LRTI可启动气道重塑过程，引起气道慢性组织病理学改变，为后续持续性哮喘的发生提供病理生理学基础。Sigurs等对婴儿期患过 RSV-LRTI的学龄儿童进行肺通气功能检测发现，该组儿童吸入支气管扩张剂前后的 FEV1/FVC 和 PEF75均明显低于对照组，提示婴儿期 RSV-LRTI启动了气道重塑过程，引起气道慢性组织病理学改变。目前关于气道重塑的机理，Holg
3、ate等提出了“上皮-间充质营养单位再活化”学说，上皮-间充质营养单位（EMTU）主要由上皮细胞及其下层的间充质细胞（成纤维细胞/肌纤维母细胞）组成，在胎儿肺部生 长发育中起重要作用。在正常情况下，肺部发育成熟后气道上皮细胞释放的生物活性分子主要是前列腺素E2(PGE2)，PGE2是花生四烯酸经环氧化酶代谢途径产生的代谢产物，可抑制间充质细胞增殖活化，使 EMTU处于休眠状态。当哮喘易感个体气道上皮受到吸入环境中有害因素的损伤时，引发异常的损伤修复过程，上皮细胞发生表型的改变，PGE2的合成减少，而多种生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF-2)、胰岛素样生长因子（IGF-1）、血小板衍生生长因
4、子（PDGF）、内皮素1（ET-1）、转化生长因子1第 2页共 65页 广州医学院硕士论文- 中文摘要（TGF- 1）、基质金属蛋白酶（MMPs）等持续分泌增加，促使 EMTU再活化，上皮下间充质细胞增生转化，平滑肌层增生肥厚，细胞外基质（ ECM）合成沉积增多，从而产生气道重塑的过程。由于半胱氨酰白三烯（CysLTs）与 PGE2合成共享相同的底物，两者的合成量存在负相关的关系，因此推测，易感个体气道上皮细胞受 RSV感染损伤后，CysLTs合成水平上调，抑制了 PGE2合成，使 EMTU再活化，从而启动了气道重塑的过程。目前有少量动物模型的研究显示 RSV感染引起气道重塑，也有研究显示 C
5、ysLTs在 RSV 相关喘息和气道重塑 过程中起重要作用。本研究为系列研究的组成部分，该系列研究的早期研究结果也发现 RSV感染人气道上皮细胞（16-HBE）与上皮下人原代支气管成纤维细胞（HPBFs）复合培养时可上调 HPBFs白三烯 C 4合成酶（LTC4S）表达并促进 CysLTs、TGF- 1和 ET-1合成，白三烯调节剂孟鲁司特（Mont）对此过程有明显抑制作用。综上所述，推测 RSV感染人气道上皮细胞可能通过上调 CysLTs的表达与分泌从而启动气道重塑的过程。但目前缺乏RSV感染人气道上皮细胞对上皮下间充质细胞增生转化和 ECM分泌水平影响的研究。另外，要系统研究 RSV感染相
6、关喘息的分子生物学机制，必须成功建立 RSV感染人气道上皮细胞的体外模型，但目前尚无公认的 RSV感染人气道上皮细胞体外模型。目的: 1.通过系列观察 RSV不同感染复数（MOI）和不同感染时间感染 16-HBE的细胞病变（CPE ）改变，探讨 RSV 感染 16-HBE最佳条件以成功建立 RSV感染 16-HBE的体外模型，为进一步系统探讨 RSV感染分子生物学机制提供有效的体外研究细胞模型；2.通过 RSV感染人气道上皮细胞与上皮下间充质细胞复合培养模型，观察RSV感染 16-HBE对 HPBFs向肌纤维母细胞转化及其 ECM分泌水平的影响，了解RSV感染气道上皮细胞能否启动气道重塑过程，
7、引起气道慢性组织病理学改变，以期探讨婴幼儿 RSV-LRTI引起慢性持续性哮喘的相关机制；3.同时观察常用的哮喘长期控制药物吸入糖皮质激素（布地奈德，BUD）及白三烯调节剂（孟鲁司特，Mont）对 RSV感染气道上皮细胞促进上皮下间充质细胞增生转化和 ECM分泌过程可能存在的抑制作用，为 RSV感染诱发的喘息和儿童哮喘有效早期预防药物的选择提供理论依据。方法:1. 细胞培养和 RSV传代、冻存、定量：培养实验所需的人喉癌上皮细胞株(HEp-2)、16-HBE 和 HPBFs。以 RSV易感的 HEp-2进行病毒的繁殖、传代、冻存，第 3页共 65页 广州医学院硕士论文- 中文摘要空斑技术测定病
8、毒感染单位量。2. RSV感染 16-HBE体外模型的建立：16-HBE细胞以 10 / ml分种于 96孔培养板，50ul /孔待细胞 70%汇合后，以 MOI分别为 0. 001、40. 01、0. 1、1. 0和 10 RSV接种，动态观察接种 24h、48h、72h、96h、120h后 16-HBE细胞形态学改变，细胞增殖活性实验检测细胞增殖活性 (GI)，并以 RT-PCR法检测16-HBE细胞中 RSV 病毒核酸和直接免疫荧光技术察知病毒相应抗原在感染细胞内的定位。3. RSV感染 16- HBE对 HPBFs向肌纤维母细胞转化的影响：HPBFs以1x105/well接种于放入一小
9、玻片的6孔板，同时16-HBE细胞以大致相同的密度接种于培养小室，以 MOI为 0. 1的 RSV接种于 16- HBE，吸附 2小时将培养小室放入培养有 HPBFs的 6孔板中。实验分 16- HBE- RSV+HPBFs组和 16- HBE+HPBFs组，复合培养 24h、48h、72h、96h和 120h，于各时间点收集 6孔板中的 HPBFs和上清液，应用间接免疫荧光法（IFA）和蛋白免疫印迹（WB）检测 -平滑肌肌动蛋白（-SMA）的表达水平，应用竞争性酶连免疫吸附试验（ELI SA）检测上清液型胶原（Col）和纤维结合蛋白（Fn）的分泌水平。4. BUD对 RSV 感染 16- H
10、BE促进 HPBFs向肌纤维母细胞转化过程的影响：HPBFs以 1x105/well接种于放入一小玻片的 6孔板，同时 16-HBE细胞以大致相同的密度接种于培养小室，以 MOI为 0. 1的 RSV接种于 16- HBE，吸附2小时将培养小室放入培养有 HPBFs的 6孔板中。实验分组：16-HBE+HPBFs 组、16-HBE-RSV+HPBFs组、16-HBE-RSV+HPBFs+BUD(10 -8mol/L)组、16-HBE-RSV+mol/L)组，复合培养HPBFs+BUD (10 mol/L)组和 16-HBE-RSV+HPBFs+BUD (10-6 -572h后收集 6孔板中的上
11、清液和细胞，检测细胞 -SMA的表达水平和上清液中 Col的分泌水平。5. Mont对 RSV 感染 16- HBE促进 HPBFs 向肌纤维母细胞转化过程的影响：HPBFs以 1x105/well接种于放入一小玻片的 6孔板，同时 16-HBE细胞以大致相同的密度接种于培养小室，以 MOI为 0. 1的 RSV接种于 16- HBE，吸附 2小时将培养小室放入培养有 HPBFs的 6孔板中。实验分组：16-HBE+HPBFs 组、16-HBE-RSV+HPBFs组、16-HBE-RSV+HPBFs+Mont(10 -7mol/L)组、16-HBERSV+HPBFs+Mont(10-6mol/
12、L)组和 16-HBE-RSV+HPBFs +Mont(10 -5mol/L)组，复合培养 72h后收集 6孔板中的上清液和细胞，检测细胞 -SMA的表达水平和上清液中 Col的分泌水平。结果:1. RSV感染 16-HBE体外模型的建立：MOI为 0.1组接种 72h后 16-HBE的GI为 0.85，即死亡细胞不多，与未感染对照组相比 85细胞仍为活细胞，光学显微镜下观察见细胞胞体增大，透亮度降低，小部分细胞呈坏死聚集状，直接免疫荧光第 4页共 65页 广州医学院硕士论文- 中文摘要技术能检测到病毒抗原在胞浆内表达，PCR技术能从 16-HBE提取的总 RNA中扩增出 RSV病毒核酸的基因
13、片段，证实 RSV 成功感染 16-HBE，且 MOI为 0.1和感染时间为 72h是 RSV感染 16-HBE最佳条件。2. RSV感染 16- HBE对 HPBFs 向肌纤维母细胞转化的影响：在 24h和 48h时，16-HBE-RSV+HPBFs 组和 16-HBE+HPBFs 组未见-SMA的表达，从 72h开始两组均有不同程度的 -SMA表达，96h表达水平最高。16-HBE-RSV+HPBFs组在 72h、96h和 120h时 -SMA的表达水平均显著高于 16-HBE+HPBFs组（t分别为 21.883、61.836和 4.826，P均0. 05），两组各时间段比较也无统计学意
14、义（F分别为 0. 882和 0. 366, P 均0. 05）。3. BUD对 RSV感染 16- HBE促进 HPBFs向肌纤维母细胞转化的影响: 16- HBE- RSV+HPBFs组-SMA的表达水平明显高于 16- HBE+HPBFs 组 ( t为 18. 913， P0. 05）。16- HBE- RSV+HPBFs 组 Col的分泌水平明显高于 16- HBE+HPBFs组( t为 35. 694，P0. 05）。4. Mont对 RSV感染 16- HBE促进 HPBFs向肌纤维母细胞转化的影响: 16- HBE- RSV+HPBFs组 -SMA的表达水平明显高于 16HBE+
15、HPBFs组（t为36. 957，P0.05). The Collevels of 16-HBE-RSV+HPBFs group were significantly higher than the 16-HBE+HPBFs group( t =35. 694, P0.05). 4. The -SMAexpression of 16-HBE-RSV+HPBFs group were significantly higher than the16-HBE+HPBFs group（ t =36. 957, P0. 05），两组各时间段比较也无统计学意义（P均 0. 05）(见表 4)。本结果提示 RSV感染 16- HBE可以促进 HPBFs向肌纤维母细胞转 化并分泌更高水平的 Col，使 ECM合成水平增加，从而参与气道重塑过程的发生。表 3 RSV感染 16-HBE对 HPBFs Col分泌水平的影响( xs)分组16- HBE+HPBFs16- HBE- RSV+
