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1、1导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型的应用【摘要 】 目的探讨对人乳头瘤病毒(HPV) 感染进行准确快速基因诊断和分型的方法。方法采用导流杂交基因芯片技术和实时荧光PCR 对 75 例疑似 HPV 感染的标本进行基因诊断和分型。结果基因芯片阳性 28 例,其中单一感染 21 例,多重感染 7 例；实时荧光 PCR阳性 25 例。二者在阳性结果中有很好的一致性。结论导流杂交基因芯片技术适合临床筛查 HPV 感染及对 HPV 进行基因分型。 【关键词】 乳头瘤病毒 人 基因型 寡核苷酸序列分析 原位杂交人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是小分子双链DNA 病毒
2、,具有强烈嗜上皮性 ,高度组织和宿主特异性, 可致人类皮肤和黏膜异常增生,引起多种良、恶性病变。目前已经鉴定 100 多种亚型, 其中近 40 种能感染生殖器官。根据其对生殖系统的致癌性不同,可将其分为低危型和高危型12 。前者包括 HPV 6,11,42,43 等亚型, 主要引发良性增生, 如尖锐湿疣；后者包括 HPV16,18,31,33,45等亚型,常引起恶性转化, 如宫颈癌。由于 HPV 的致病性与其型别密切相关,所以对其进行检测和分型对宫颈癌的早期筛查、防治、预后2判断等具有重要的临床意义。笔者对 75 例疑似 HPV 感染的标本同时进行导流杂交基因芯片技术(flowthrough
3、hybridization and gene chip)即凯普导流杂交 HPV DNA 检测(简称 HybrMax)和荧光定量 PCR 检测,探讨 HybrMax 在 HPV 检测中的应用价值。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本来源、采集、保存 75 例标本取自 2006 年 6-12 月福建医科大学附属协和医院疑似 HPV 感染的门诊女性患者,年龄(2610.6)岁(1839 岁)。采集宫颈口棉拭子标本, 将取样后的棉拭子放入备有无菌生理盐水 1 mL 的加盖微量离心管(1.5 mL)中,采集的样本在室温放置2 h,4 保存24 h,-20 保存3 个月,样本避免反复冻融。1.1.2
4、 试剂及仪器 HPV DNA 抽提试剂盒 (QIA Mini 试剂盒, 德国QIAGEN 公司 ),HPV 基因分型检测试剂盒(中国凯普生物科技有限公司),可检测 21 种 HPV 亚型, 包括 13 种高危亚型(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 和 68 型)、5 种低危亚型(6,11,42,43 和 44 型)和 3 种中国人群常见亚型(53,66 和 CP8304型)。另外在膜上还包括用于质量控制的阴性对照点、内对照点(用3于监测 PCR 反应)和 Biotin 对照点(用于监测显色系统)；HPV6/11、16、和 18 型实时荧光 PCR 检测试剂
5、盒(深圳匹基生物有限公司)；扩增仪 (PE9700，美国 ABI 公司 )；荧光定量 PCR 仪(LightCycler，瑞士 Roche 公司)；医用核酸分子快速杂分仪（中国凯普公司） 。1.2 方法1.2.1 标本 DNA 提取取上述液体 0.5 mL,13 000 r/min 离心 1 min,弃上清液, 利用 QIA Mini 试剂盒提取 DNA,具体操作步骤按试剂盒说明书。1.2.2HybrMax 法检测 21 种 HPV 亚型1.2.2.1 标本 DNA 扩增将水、PCRMIX 、Taq 酶和 DNA 模板按要求混匀,反应体系为 25 L。PCR 反应条件为 20 10 min,9
6、5 预变性 9 min；95 20 s55 30 s72 30 s 共 40 个循环,72 延伸 5 min。1.2.2.2 导流杂交将扩增后的 PCR 产物加热变性后冰浴,同时将固定有核酸探针的膜固定在杂交仪上,进行预杂交。把 PCR 产物加到4薄膜上,让样品流入膜内进行导流杂交, 清洗除去未结合的 DNA,整个杂交过程保持在 45 。1.2.2.3 芯片显色及结果判读用封阻液封闭膜, 孵育 5 min,重复 2次。排出封阻液后加入酶标液,25 温育 3.5 min。用冲洗缓冲液彻底冲洗膜,除去未结合的酶标液, 后加入 NBT/BCIP 底物显色 35 min。在显色后 1 h 内分析结果。
7、1.2.3 实时荧光 PCR 测定 HPV 亚型按照试剂 说明书对每份标本检测 HPV6/11、16 和 18 等 4 种亚型。1.3 统计学处理 2 种方法检测结果比较用秩和检验,P0.05 为差别有统计学意义。2 结果2.1HybrMax 法检测所有膜上阴性对照结果均为阴性,内对照点和Biotin 对照点均为阳性。75 例样本共 28 例阳性,其中单一感染 21例, 复合感染 7 例。HPV 单一感染时, 在膜芯片上相应 HPV 亚型探针位点处可见一蓝紫色斑点,双重或多重感染时,在膜上可见两个或两个以上显色斑点(图 1)。2.2 荧光定量 PCR 检测 75 例样本共检出 25 例阳性,
8、其中单一5HPV6/11 亚型阳性 15 例,单一 HPV16 亚型阳性 3 例,单一 HPV18亚型阳性 2 例,HPV6/11 和 HPV16 均阳性 1 例,HPV6/11 和HPV18 均阳性 4 例。2.3HybrMax 法与荧光定量 PCR 比较 75 例标本 HybrMax 法28 例阳性,荧光定量 PCR 25 例阳性, 经统计分析显示其差别无统计学意义(P0.05),表明二者在阳性结果中有较好的一致性, 但实时荧光 PCR 有一定的漏检率,漏检标本包括 2 例 53 亚型及 58 亚型的单一感染和 1 例 35 和 58 亚型的复合感染。另外 4 例复合型感染除了有常见的 6
9、，11，16，18 亚型外,还检出 31，53,58,66 及 CP8304亚型(表 1,2)。在以上检测到的亚型中 33，58 ，66 亚型都为 HPV的高危亚型,说明 HybrMax 法在检测 HPV 复合感染以及高危型HPV 检出方面具有优势。3 讨论宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,临床证明 95.099.7宫颈癌和高危型 HPV 感染有关3 。而且不同亚型 HPV 对子宫颈癌致癌性有不同影响,因此,准确诊断HPV 感染及其分型对宫颈癌筛查、早期确诊及治疗效果监测有着重大意义。6HPV 分型检测研究一直受到国内外学者的高度重视4。目前,对HPV 感染的分型诊断主要方法有斑点杂交、Sout
10、hern 印迹及实时荧光 PCR 等。传统的斑点杂交、Southern 印迹由于杂交过程操作复杂, 耗时长( 杂交需十几个小时甚至 1 d),检测低拷贝基因的敏感性不足, 可能需要使用同位素等, 表 1 基因芯片结果与荧光定量 PCR 结果的比较:由于匹基实时荧光 PCR 的试剂不能对 HPV6 和 11 两种亚型分别进行检测,因此, 当患者感染其中任何一种亚型时,其检测结果表示为 HPV6/11 亚型阳性 .表 2 荧光定量 PCR 和基因芯片结果的2 检验不适合临床常规检测。实时荧光 PCR 检测 HPV DNA 已经应用于临床,其灵敏度和可靠性已得到认可,但目前能检测的 HPV 亚型十分
11、有限,主要包括常见的 HPV6,11,16,18 四种亚型5,易漏诊其他 HPV 亚型的感染,不利于流行病学和病因学的进一步深入研究。基因芯片是近年来发展起来的可对病原体核酸进行高通量快速检测的技术6。HybrMax 法是导流杂交技术结合低密度基因芯片技术, 利用 PCR 扩增提高检测的灵敏度,分子杂交特异性高,是 HPV 基因型分型检测的新方法7。运用其高通量检测的特点,达到对 21 种常见高危型和低危型 HPV 亚型在同一样品中进行分型检测。与现有的实时荧光 PCR 相比,具有很多优点:(1)利用芯片高通量的特点可一次性检测 21 种亚型,增加了 HPV 感染的检出率及7不同亚型复合感染的
12、检测率3,尤其是高危型的检出；(2) 芯片设计考虑了中国人感染 HPV 的特点, 包含了中国人常见的 3 个亚型(53，66 和 CP8304 亚型), 有利于在我国筛查 HPV 感染；(3)有良好的质量控制体系。基因芯片上包括了阴性对照点、内对照点和biotin 对照点, 对基因扩增和杂交实行了全程控制； (4)整个检测过程仅需 3.5 h 就可出具检验报告,检测时间短,能满足临床需要；(5) 结果可靠。本实验通过与实时荧光 PCR 的结果对比,说明 HybrMax 法的检测结果具有与荧光定量 PCR 相当的灵敏度和可靠性。本研究中,HybrMax 法共检出 10 种 HPV 基因型,其中高
13、危型的检出率为 18.7,混合型 9.3；而实时荧光 PCR 技术检出高危型13.3,混合型 6.7。HybrMax 法检出的高危型别包括HPV16，18，31 ，35，53，58，66 型, 其中 HPV16，18 型与泌尿生殖道肿瘤关系密切,尤其是宫颈癌。所以对尖锐湿疣患者进行HPV DNA 的基因分型,对于判定预后, 指导临床对高危型及多重型HPV 感染患者长期随访, 采取针对治疗措施 ,降低与 HPV 相关肿瘤的发生率有重要意义。HybrMax 法检测 HPV 亚型包含了 PCR 技术的高敏感性、导流杂交技术的快速性和基因芯片的高通量性,是一种适合目前临床筛查HPV 感染同时对 HPV
14、 进行基因分型的有效方法。虽然目前基因芯片技术成本昂贵,检测的可靠性、实用性还有待于进一步验证,但基因8芯片技术用于 HPV 的分型检测有广阔的前景。【参考文献】1Dunne E F,Markowitz L E. Genital human papillomavirus infectionJ. Clin Infect Dis, 2006, 43(5):624629.2Trottier H,Franco E L. The epidemiology of genital human papillomavirus infectionJ. Vaccine, 2006, 24(Suppl 1):115.
15、3乌兰娜, 吴瑞芳 ,周艳秋,等. 人乳头瘤病毒基因亚型与宫颈病变的关系J. 中华妇产科临床杂志, 2005,6(5):346350.4Wright J D,Herzog T J. Human papillomavirus: emerging trends in detection and managementJCurr Women Health Rep, 2002, 2: 2592655牛淑芳. 人乳头瘤病毒检测的研究进展J. 实用肿瘤学杂志, 2006, 20(2):143145.6府伟灵. 生物芯片研究现状及展望 J. 解放军检验医学杂志, 92002,1(2):107109.7陶萍萍, 卞美璐 ,欧华,等. 导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒检测中应用的研究J. 中华妇产科杂志, 2006,41(1):4347.
