《等电聚焦电泳》由会员分享，可在线阅读，更多相关《等电聚焦电泳（24页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、等 电 聚 焦 电 泳,报告人：- 时 间：09.10.16,主 要 内 容：,等电聚焦基本原理 pH梯度的组成 pH梯度支持介质 载体两性电解质 等电聚焦电泳分离蛋白质 （通过举例讲一下具体的操作步骤）,等电聚焦的基本原理,等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。 在等电聚焦的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。,等电点(pI),以氨基乙酸为例,离解平衡为:NH3+CH2COOH
2、NH3+CH2COO- NH2CH2COO-氨基乙酸 Ka1 双极离子 Ka2 氨基乙酸 阳离子 pI=(pKa1+pKa2)/2 阴离子 当氨基酸的各种带电离子所带正电荷数与负电荷数相等时,此时溶液的pH就是这种氨基酸的等电点(pI). 蛋白质是由氨基酸组成的,除了有末端-NH3+和末端-COO-外,参与其组成的氨基酸残基侧链上还有酸、碱性基团,因此蛋白质是两性物质,也有等电点.,等电聚焦的基本原理,不同的蛋白质或其他两性电解质具有不同的等电点。如果某种蛋白质处于大于其等电点的pH环境中，则带负电，在电场中必向正极泳动；反之，当某种蛋白质处于小于其等电点的pH环境中，则带正电，在电场中向负极
3、泳动。 如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由低到高(即环境由酸至碱)的连续而稳定的pH梯度，则处于这一系统的各种蛋白质分子，将根据各自pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。,等电聚焦的基本原理,在蛋白质颗粒向相反电极泳动的过程中，其逐渐靠近与其pI相同的pH位点，不断失去净电荷，直至到达pH=pI，即净电荷为零时，不再受到电场力的作用，而达到聚焦。 所以，如果将等电点各不相同的蛋白质混合物加入这种具有pH梯度的介质中电泳(不论加在何位置)，经过一段时间后，各种蛋白质分子将由阳极至阴极按等电点大小依次聚焦在与各自等电点相应的pH介质区域，而形成一系列的蛋白质区带。,等电聚焦的基本
4、原理,这就是等电聚焦电泳分离蛋白质的基本原理。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。 如下图所示：,等电聚焦电泳,加 酸,加 碱,pI,小,大,pH,高,低,关键是形成pH梯度,pH梯度的组成,pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性较差，现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱
5、液，如氢氧化钠、氨水等。,pH梯度的组成,电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于pI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。,pH梯度的组成,由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2pI1，因此定位于第一种两性电解质之后，这样，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，
6、形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的线性pH梯度。,pH梯度支持介质,常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。 琼脂糖凝胶（agarose gel ），依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40以上开始融化。,载体两性电解质,两性电解质，是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下，自然形成pH梯度，是一种特殊的缓冲液。 理想的载体两性电解质应在pI处有足够的缓冲能力
7、及电导，前者保证pH梯度的稳定，后者允许一定的电流通过。,载体两性电解质,不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小，易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开,而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。 不同品牌的载体两性电解质性质上有细微的差别，使用不同来源的载体两性电解质凝胶时候蛋白质分离样式略有差异，若要获得最好的重复性一般不要更换载体两性电解质的品牌。,电泳仪-AE6541,电泳仪-伯乐bio-rad,电泳仪-实验室,电泳槽-DYCP32型,等电聚焦电泳分离蛋白质,一、仪器与试剂 1仪 器： JY5000电泳仪、DYCP32型电泳槽
8、 2试 剂：蛋白质样品、载体两性电解质、 琼脂糖、溴酚蓝、蒸馏水 电极液：0.5M醋酸溶液（阳极液）、 0.5M氢氧化钠溶液（阴极液）,等电聚焦电泳分离蛋白质,二、操作步骤： 1、配胶 胶液组成：载体两性电解质（pH3.5-9.5）1.0mL+样 品+溴酚蓝一滴+蒸馏水8.5mL+琼脂糖0.1g 2、灌胶 将胶液升温至75，保温将胶液灌到塑料管中。灌胶过程注意不要产生气泡。冷却两小时后可接入电泳池。,等电聚焦电泳分离蛋白质,3、加电极液 阴阳两极分别加入80mL电极液。阳极：0.5M醋酸溶液，阴极：0.5M氢氧化钠溶液。两边均需没过胶管头。4、电泳 使用JY5000电泳仪，调整电流，使功率保持
9、在1-2W左右。电流开始较大，聚焦过程有所下降。当每条管中的溴酚蓝集中成一点时，停止电泳。整个电泳过程约6个小时。,等电聚焦电泳分离蛋白质,5、样品收集 将胶管以溴酚蓝点为中心，分别切为1cm的小段。然后将胶管中的胶体分别挤入5mL的离心管中，每个离心管分别加入4mL去离子水，在90Hz下超声3小时。 用于进一步检测。,等电聚焦电泳分离蛋白质,三、注意事项 1、两性电解质是等电聚焦的关键试剂,它的含量 2-3较合适。使用完毕之后，请及时放入冰 箱中保存。 2、灌胶过程中，注意塑料管中不能有气泡，否则电 泳时离子无法通过。 3、电泳时，电泳槽中一定要加上盖子，否则胶体会 胀出塑料管外 。 4、所有水都用去离子水。 5、电泳过程中，功率是不断变化的，要注意随时调 整。,谢 谢 ！,
