《变性高效液相色谱进行HLA-DRB1配型的可行性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《变性高效液相色谱进行HLA-DRB1配型的可行性研究（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1变性高效液相色谱进行 HLA-DRB1 配型的可行性研究作者：王静波李丹潘凯枫陆道培【摘要 】 为了探讨通过变性高效液相色谱（DHPLC）进行HLA-DRB1 配型的可行性， 选择经 PCR-SSP 证实的 20 例 HLA-DRB1 相合及 2 例 HLA-DRB1 不相合的病人及其同胞供者的标本为实验对象，全部标本通过 PCR 扩增 HLA-DRB1 第二外显子基因片段，PCR 产物经梯度变性处理后通过 DHPLC 检测，在部分变性温度下，检测病人与供者的 HLA-DRB1 第二外显子 DHPLC 峰型是否相同，以判断供受者的 HLA-DRB1 基因型是否相同。结果表明： DHPLC 与
2、 PCR-SSP 进行 DRB1 配型比较分析, 经 kappa 检验，kappa 值为 0.776， P 值0.00， 说明两种方法的配型结果无显著性差别。结论： 变性高效液相色谱方法用于 HLA-DRB1 配型方便, 经济实用并解决了 HLA 新基因的不断出现与相应的位点的引物或探针设计和开发的相对滞后之间的矛盾。 【关键词】 DHPLC HLA-DRB1 配型 PCR-SSPFeasibility of HLA-DRB1 Matching by Using DHPLC2AbstractTo study feasibility of HLA-DRB1 matching by using d
3、enatured high performance liquid chromatography （DHPLC） ， 20 pairs of DNA samples from donors and recipients of hematopoietic cell transplantation (HCT) for DRB1 matching and 2 pairs of samples from donors and recipient of HCT for DRB1 mismatching were studied by DHPLC and PCR-SSP. After being ampli
4、fied and annealed slowly to produce heteroduplex， PCR products for exon 2 of DRB1 were detected by DHPLC to find matched or mismatched peaks in chromatogram. The results showed that DHPLC and PCR-SSP were consistant with matched or mismatched HLA-DRB1 typing. The results of DHPLC and PCR-SSP for mat
5、ching were compared by using kappa test（kappa0.776 , P= 0.00）,which suggested DHPLC for HLA-DRB1 matching was in agreement with PCR-SSP. In conclusion, DHPLC for HLA-DRB1 matching is economic and convenient, moreover, will not be affected by unknown genes in HLA-DRB1 locus.Key words DHPLC; HLA-DRB1
6、matching; PCR-SSP3变性高效液相色谱（DHPLC）是一种新型的检测基因的多态性的方法1 。这种方法是根据含有异源双链的 PCR 产物中不匹配碱基的种类，数量及排列顺序以及位置的差异产生不同的的 DHPLC峰型，从而推测目的基因的多态性。由于 HLA-DRB1 片段的高度多态性，每一个等位基因的多态碱基的种类，数量及位置均不相同，其 DHPLC 峰型也应该不同。通过 DHPLC 进行供受者样本的基因型的直接比对，如果供受者的 HLA 基因型相同，则其 DHPLC 峰型也应该相同。反之，则 DHPLC 峰型不相同，从而达到判断供受者HLA 配型是否相合的目的。编码 HLA-DRB1
7、 抗原多态性的基因主要在 HLA-DRB1 第二外显子2 ，因此我们的研究重点主要在HLA-DRB1 的外显子 2。材料和方法标本来源22 对病人及其同胞供者标本均来自北京大学人民医院血液病研究所。DNA 提取取抗凝血 5 ml， 525g 离心 10 分钟。吸出白细胞层，加4入红细胞裂解液 10 ml，室温放置 20 分钟， 365g 离心 10 分钟，弃上清，重复 2 次，然后加入白细胞裂解液 3 ml，蛋白酶 K（10 mg/ml）75 l、10% SDS 200 l、37过夜后加入 6 mol/L 氯化钠 1ml 震摇 15 秒，充分混合后置 4冰箱 20 分钟， 2 220g 离心2
8、0 分钟，将上清液移至另一试管，加入等体积无水乙醇，封口倒转试管数次至絮状物折出，将絮状物移至 1 ml EP 管中，加入 75%乙醇 0.8 ml，16 210g 离心 1 分钟，重复 2 次，弃上清，室温干燥30 分钟，加入 300 l TE 溶液，DNA 溶解后进行定量。PCRPCR 扩增 HLA-RB1 外显子 2 引物为 5GGAGGCCGCCTGTGTGACTG3, 5CCCAGCTCACAGGGACTCAGG3。扩增片段为 353 bp, 25l PCR 体系包括： 50 ng 基因组 DNA,0.2 mol/L 引物,200 mol/L dNTP，2 U pfu，2 mmol/
9、L 氯化镁。扩增条件为 94 4 分钟, 94 45 秒，72 1 分钟 20 秒，35 个循环，72 延伸 10 分钟。DRB1 的 DHPLC 分型及比对PCR 产物经过 95 3 分钟变性，然后每分钟降 1，直至545，PCR 产物不需纯化处理，可直接通过 DHPLC 在部分变性温度下进行检测。流动相为 0.1 mol/L TEAA（pH 7.0）和 25%乙腈（acetonitrile） ，按不同梯度进行混合，部分变性温度为 65.5, 流速 0.9 ml/min，PCR 产物首先在柱温 50 下检测，观察其DHPLC 峰型是否为一单峰。如果 DHPLC 峰型为一单峰说明 PCR产物中
10、无非特异性扩增产物。然后，根据外显子 2 的熔解曲线设定柱温（部分变性温度）为 65.5。在此温度下，具有不同 HLA-DRB1 等位基因的 PCR 产物可产生不同的 DHLPC 峰型，每一种DHPLC 峰型都会产生不同的保留时间，保留时间相同，则 DHPLC峰型也相同。根据保留时间和 DHPLC 峰型是否相同判断 HLA-DRB1 配型是否相同，其结果通过 UV260 紫外检测，WAVE MAKER 系统自动存盘。PCR 产物克隆测序对 DRB1 为杂合子的样本进行 T-A 克隆测序，对纯合子样本可进行 PCR 产物直接测序。pGEM-T 载体试剂盒购自美国Promega 公司，DNA 克隆
11、测序由上海申友生物技术有限公司在ABI PRISMTM377 型 DNA 测序仪上进行。PCR-SSP6采用美国 PEL-FREEZ 公司试剂盒标准方法进行。简言之，将待测标本加入含有 taq 酶及缓冲液、dNTP 的反应物中，96 预变性 1 分钟，96 25 秒，70 50 秒，72 45 秒，共 5 个循环；96 25 秒，65 50 秒，72 45 秒，共 21 个循环；96 25 秒，55 60 秒，72 120 秒，共 4 个循环。统计学分析DHPLC 与 PCR-SSP 进行 HLA-DRB1 配行结果比较，采用kappa 检验。结果HLA-DRB1 PCR-SSP 法配型结果2
12、2 例病人及其同胞供者的 DNA 经 PCR-SSP 方法检测 HLA-DRB1 基因型，结果发现 20 例病人及其同胞供者 HLA-DRB1 基因型相同，另 2 例病人及其同胞供者 HLA-DRB1 基因型不同（图 1，附表） 。 Table . Comparison of DRB1 matching results by using DHPLC and PCR-SSP（略）HLA-DRB1 纯合及杂合样本 DHPLC 的检测结果7根据 PCR-SSP 方法检测的 HLA-DRB1 的配型结果，选择 2例 HLA-DRB1 纯合样本及 1 例 HLA-DRB1 杂合样本，在 DHPLC的 D
13、NA 分离柱温度为 50时，DRB1 纯合样本（图 2）及杂合样本（图 3）均表现为单峰。当 DNA 分离柱温度逐渐升高时， DRB1纯合样本仍表现为单峰（图 2） ，DRB1 杂合样本 随着 DNA 分离柱温度的升高逐渐变成多个峰（图 3） 。等位基因不同的两个纯合样本在一定的分离柱温度下表现为单峰，但混合后出现杂合峰型（图 4） 。图 2、3、4 中，左侧数字代表 DRB1 的基因型及 DNA 分离柱温度，右侧数字代表每个样本的编号。HLA-DRB1 DHPLC 配型结果在确定 HLA-DRB1 纯合样本及 HLA-DRB1 杂合样本在DNA 分离柱温度为 50 时均表现为单峰以及 HLA
14、-DRB1 杂合样本的 DNA 分离柱的最佳温度( 部分变性温度) 为 65.5后，在部分变性温度为 65.5时检测 22 对经 PCR-SSP 检测 HLA-DRB1 相合及2 对经 PCR-SSP 检测 HLA-DRB1 不相合的样本。实验结果表明，PCR-SSP 与 DHPLC 两种方法比较分析，仅 1 对不相符，经 kappa检验，kappa 值为 0.776, 95的可信区间为 0.357-1.000， P 值为 0.00。 Kappa 检验是假设二组样本属于不同总体 P=0.00，这说明二组样本在不同总体的概率为 0，所以二次样本 HLA 配型结果无显著差别，属于同一总体（附表）
15、。图 5 为 DHPLC 图谱，共包括 68组分图，在每一组图中，第一个峰为病人的色谱峰，第二个峰为供者的色谱峰，第三个峰为供受者标本混合后产生的色谱峰，供受者峰型相同并且供受者标本混合后峰型无改变时被认为 HLADRB1配型相同，反之则认为 HLADRB1 配型不同。在每组图中，左侧数字代表 DRB1 的基因型，右侧数字代表每个样本的编号。其中，前3 组图为 DHPLC 方法和 PCR-SSP 方法配型均完全相合的标本，第4 组图为 PCR-SSP 方法配型相合， DHPLC 方法配型不相合的标本，第 5 组图和第 6 组图为 DHPLC 方法和 PCR-SSP 方法配型均不相合的标本。 1
16、 对标本经 DNA 测序验证其结果与 DHPLC 配型结果一致（图 6-7） 。讨论DHPLC 是一种新型的检测基因多态性的方法1 ，其原理是通过 PCR 产物变性后逐渐降温以形成异源双链，即异源双链中只有部分碱基相匹配，再根据目的基因片段的熔解曲线设计其部分变性温度（部分变性温度是指 DNA 双链比例在 50%至 75%之间的温度） 。在该温度下，由于异源双链中存在不匹配的碱基，与同源双链相比，更易解成单链，首先通过 DNA 分离柱并被检测器检测。因此，含有异源双链的 PCR 产物与只含有同源双链的 PCR 产物在DHPLC 检测器上出现时间（保留时间）不同，从而会产生不同的DHPLC 峰型。而且，不同的异源双链中，由于其不匹配碱基的种类，9数量及排列顺序以及位置的差异，其在部分变性温度下形成不同比例的单链，因此在 DHPLC 检测器上出现不同的保留时间，从而会产生不同的 DHPLC
