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1、1反义 bcl作者：葛正龙，范芳，李长福，李海祥，曾小平【关键词】 基因Effect of antisense oligodeoxynucleotide bcl2 on expression of Bcl2 protein and cell cycle of lens epithelial cells induced by galactose【Abstract】 AIM: To investigate the effect of antisense oligodeoxynucleotide bcl2 (bcl2 ASODN) on the expression of Bcl2 protein
2、and the cell cycle of rabbit lens epithelial cells（LECs）induced by galactose. METHODS: From translation initiation region of bcl2 gene, oligonucleotides were synthesized and modified with phosphorothioate. Rabbit lens were treated with galactose and bcl2 ASODN. The influence of bcl2 ASODN on the lev
3、el of Bcl2 protein expression and the cell cycle of LECs induced by galactose was detected by flow cytometry. RESULTS: 5.0-15.0mol/L of bcl2 ASODN reduced the level of Bcl2 protein expression on LECs induced by galactose, with the fluorescence intensity 2decreasing from 158.702.14 to 113.942.88, and
4、 decreased the number of S phase cells of Lens from 20.60% to. 0.67%. CONCLUSION: bcl2 ASODN can inhibit the level of Bcl2 protein expression on LECs induced by galactose, interfere the entry of LECs into the S phase and inhibit the proliferation of LECs.【Keywords】 genes, bcl2; oligonucleotides, ant
5、isense; galactose; lens, crystalline/cytology【摘要】 目的： 探讨反义 bcl2 寡核苷酸(bcl2 ASODN)对半乳糖诱导的兔晶状体中 Bcl2 蛋白表达及细胞周期的影响. 方法： 人工合成与 bcl2 基因翻译起始区序列互补的寡核苷酸并磷酸化修饰，用半乳糖和 bcl2 ASODN 处理体外培养的兔晶状体，流式细胞术检测 bcl2 ASODN 对半乳糖诱导的 LEC 中 Bcl2 蛋白表达水平及细胞周期的影响. 结果： 5.0 15.0 mol/L反义 bcl2 寡核苷酸能下调半乳糖诱导的晶状体上皮细胞中 Bcl2 蛋白的表达，荧光强度从158
6、.702.14 降至 113.942.88，同时可降低 S 期细胞数，从20.60%降至 0.67%. 结论： bcl2 ASODN 能抑制半乳糖诱导的晶状体中 Bcl2 蛋白的表达水平，阻止细胞进入 S 期，抑制细胞增殖. 【关键词】 基因，bcl2 ；寡核苷酸类，反义；半乳糖；晶3体/ 细胞学0 引言近年的研究表明，一些癌基因的异常表达与晶状体上皮细胞（lens epithelial cells, LEC）的增殖和分化密切相关，bcl2 基因是一种与细胞增殖、分化和凋亡密切相关的原癌基因，研究认为 LEC的增殖与 bcl2 基因的表达有关1 ，而 bcl2 的过度表达能诱导转基因鼠白内障的
7、形成. 为了探讨白内障的发病机制及反义 bcl2 寡核苷酸片段对半乳糖性白内障治疗的可行性，我们通过导入 bcl2 ASODN，观察其对半乳糖诱导的晶状体中 Bcl2 蛋白表达及细胞周期的影响，现报道如下.1 材料和方法1.1 材料反义寡核苷酸的制备：根据 bcl2 基因翻译起始区序列设计ASODN，碱基序列如下2 ： 5AGCGTCCGCCATCCTTCC3 （由上海 Sangong 公司合成，两端各硫代修饰 3 个碱基）. 使用前加消毒双蒸水溶解，配成浓度为 61.6 mol/L的原液，于 95 水浴变性 5 min，冰上骤冷备用. 临用前用 DMEM 培养液稀释成相应浓4度使用. 1.2
8、 方法1.2.1 晶状体组织培养取 46 wk 白色无眼疾家兔，雌雄不拘，体质量 0.40.75 kg，耳缘静脉空气栓塞处死，立即按常规无菌操作摘除眼球，11000 庆大霉素生理盐水冲洗干净，在超净台内剪去角膜和虹膜，用眼科无齿镊小心取出完整晶状体放入含 DMEM完全培养基的 24 孔培养板中，每孔放置 1 枚晶状体，37, 50 mL/L CO2 条件下培养，2 d 后取出观察，除去在剥取过程中受损的晶状体，选择完好透明的晶状体待用. 1.2.2 实验分组培养晶状体组织加入无血清培养基使细胞同步化，继续培养 24 h 后换用含 50 mL/L FBS 的 DMEM 培养基，实验分为 3 大组
9、，第 1 组为正常对照组，只加培养基（含 50 mL/L FBS） ；第 2 组为半乳糖组，加含 30 mmol/L 半乳糖的培养基；第3 组为 bcl2 ASODN 组，培养基（含 30 mmol/L 半乳糖）中 bcl2 ASODN 终浓度分别为 5.0, 10.0, 15.0 mol/L. 每组设 6 个平行组，取平均值. 1.2.3 流式细胞仪检测 Bcl2 蛋白的变化上述各组晶状体组织培养 24 h 后取出，分离晶状体前囊膜，剪碎，细胞分离机分离后5800 r/min 离心 8 min，弃上清（去掉组织碎片） ，加 PBS 2 mL 振荡混匀制成单细胞悬液，10 g/L 多聚甲醛室温
10、固定， 1500 r/min离心 8 min，弃固定液，细胞重悬于 5 mL/L Triton X100 1 mL 中，37水浴 30 min，以增加细胞膜通透性并封闭非特异性抗原，离心，沉淀分别按组加入 100 L一抗（bcl2 多克隆抗体） ，另设一组以 100 L PBS 代替一抗作为上机时的空白对照组，室温放置 30 min 后离心，冷 PBS 洗涤 23 次，加 FITC 标记的二抗 100 L，避光放置 30 min；冷 PBS 洗涤去除未结合的多余荧光抗体，离心后沉淀加 500 L PBS 上机检测. 每份样本采集细胞 2105 个，以平均荧光强度表示蛋白质含量. 通过流式细胞仪
11、观察 bcl2 ASODN对高糖条件下晶状体上皮细胞中 bcl2 基因表达水平的影响. 1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期的变化培养晶状体分组同上，培养 24 h 后取出晶状体，剪碎，用细胞分离机制备单细胞悬液，PBS 洗涤后加碘化丙啶（PI，终浓度 50 mg/L）1 mL ，4避光 2 h 后流式细胞仪检测 bcl2 ASODN 对高糖条件下 LEC 细胞周期的影响. 统计学处理： 以 xs 表示实验数据，采用 SPSS 软件（10.0版本）进行方差分析，方差齐的两两比较用 LSD 法，方差不齐的两两比较用 Dunnett T3 法，P0.05 表示有显著性差异.2 结果62.1bcl2
12、ASODN 对高糖诱导的晶状体中 bcl2 基因表达的抑制作用通过 FACS 流式细胞仪检测 bcl2 ASODN 对高糖条件下培养的晶状体中 bcl2 基因表达的影响，以平均荧光强度表示蛋白的相对含量. 结果显示半乳糖能诱导 LEC 中 bcl2 基因表达增强，其荧光强度为对照组的 1.57 倍（P0.05 ）. 半乳糖诱导的晶状体经 bcl2 ASODN 处理 24 h 后， ASODN 浓度从 5.015.0 mol/L均有抑制作用，随浓度增大而抑制作用增强，与半乳糖组相比均有显著性差异（P0.05）. 结果说明 ASODN 能下调 bcl2 基因的表达（Tab 1, Fig 1）. 表
13、 1bcl2 ASODN 对晶状体上皮细胞中 bcl2 基因表达和细胞周期的影响（略）2.2bcl2 ASODN 对细胞周期的影响流式细胞术能迅速分析细胞群中各细胞周期时相的组成，其中 S 期百分率常作为比较细胞增殖活性的指标. 在晶状体中加入半乳糖后，S 期细胞数由 0.3%急剧增加至 20.6%，提示半乳糖能诱导 LEC 进入 S 期. 导入 bcl2 ASODN 后，随 ASODN 浓度增加（5.0 15.0 mol/L）S 期细胞数明显减少（Tab 1）. 3 讨论癌基因是一类与细胞的增殖分化密切相关的基因，目前对癌7基因的研究已扩展到非肿瘤领域. 与白内障的发生发展有关的癌基因有 b
14、cl2、cmyc、cfos 等. bcl2 基因是 1984 年 Tsjimoto 等从 B细胞滤泡性淋巴瘤染色体断裂点发现的凋亡抑制基因，它可以使细胞寿命延长、生长失去平衡，造成细胞数目增多3. 研究表明LEC 的增殖与 bcl2 基因的表达有关1 ，其过度表达能诱导转基因鼠白内障的形成，提示 bcl2 基因是白内障发生发展过程中的关键基因，而抑制 bcl2 基因的异常表达是阻断白内障发生发展的一个有效途径.随着细胞生物学、分子生物学的蓬勃发展，对白内障发病机制的研究已深入到分子水平. 作为一种新的可能的治疗手段，基因治疗日益受到人们的关注. 反义寡核苷酸（ASODN）是能与特异的mRNA
15、或 DNA 互补结合并抑制其转录和翻译的一段寡核苷酸链，具有封闭（抑制）特定基因表达的作用，ASODN 治疗已成为近年发展起来的基因治疗的一项重要技术. 我们已成功将 bcl2 ASODN、cmyc ASOND 导入高糖诱导的 LEC 中，并观察到 bcl2 ASODN 能抑制半乳糖诱导的晶状体上皮细胞的增殖，而 cmyc ASODN 对 cmyc 基因表达及细胞增殖均有抑制作用 4,5.鉴于此，为了继续探讨 bcl2 基因在白内障发生发展中的作用，研究 bcl2 ASODN 对高糖条件下晶状体上皮细胞的影响，本研究合成了与 bcl2 基因翻译起始区序列互补的反义寡核苷酸，利用流式细8胞仪观察
16、其对半乳糖诱导的晶状体上皮细胞中 bcl2 基因表达及细胞周期的影响. 结果显示，在培养基中加入 30 mmol/L 半乳糖后，bcl2 基因表达增强. 导入 5.0 15.0 mol/L bcl2 ASODN 作用 24 h 后，bcl2 ASODN 对晶状体中 bcl2 基因表达均有抑制作用，且浓度增大而抑制作用增强. 实验结果表明 bcl2 基因的高表达可能是半乳糖性白内障形成过程中的一个早期变化，一定浓度的 bcl2 ASODN 能下调 bcl2 基因的表达. 我们还通过流式细胞仪（FCM）观察了 bcl2 ASODN 对细胞周期的影响，显示 LEC 正常情况下大多处于静息状态（G0G1 期细胞占 91.16%，S 期细胞仅有 0.30%）. 在 LEC 中加入半乳糖后，由 G0G1 期进入 S 期的细胞明显增多， S 期细胞数由 0.30%急剧增加至 20.60%，此时细胞增殖活跃，这也许是 bc
