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1、1原癌基因表达在哮喘气道重塑中的作用作者：刘颖格戚好文李焕章 【关键词】 原癌基因 关键词: 原癌基因;哮喘; 气道重塑;豚鼠 摘 要:目的 观察原癌基因表达在哮喘气道重塑中的作用. 方法 卵蛋白致敏豚鼠建立哮喘模型， Dot-blot，North-ern-blot 分子杂交及免疫组织化学技术观察豚鼠气道上皮、肺组织中原癌基因c-fos，c-myc，c-jun 和 c-sis 的表达及其与气道重塑的关系. 结果 正常豚鼠气道及肺组织中 c-fos 和 c-myc mRNA 无或很少表达，哮喘发作后，豚鼠气道上皮及肺组织 c-fos 和 c-myc mRNA 表达明显增加;免疫组织化学染色显示
2、Fos，Myc，Jun 及 Sis 在正常豚鼠低水平表达，4 种原癌基因产物表达增加.阳性反应细胞主要分布于气道上皮细胞胞质、气管及细支气管的上皮细胞胞核及浸润的炎症细胞中.病理结果显示气道粘膜及小支气管平滑肌周围淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润，气道平滑肌显著增生. 结论 原癌基因表达在气道重塑过程中有重要作用. Keywords:oncoges;asthma;airway remodeling;guinea pigs 2Abstract:AIM To explore the role of proto-oncogenes in the process of airway remode
3、ling in asthma.METHODS Guinea pigs were used as asthma models challenged by ovoglobulin.Dot-blot，Northern-blot molecular hybridization and immunohistochemistry techniques were used to detect the expression of c-fos，c-myc，c-jun and c-sis.RESULTS c-fos and c-myc mRNA could not be detected or expressed
4、 at very low level in the control group.They were greatly increased after the guinea pigs were challenged by ovoglobulin.30minafter the challenge，the expressions of c-fos and c-myc mR-NA reached the peak and returned to normal4h after the challenge.Immunohistochemistry study showed that Fos，Myc，Jun
5、and Sis expressed at low level in control group and increased after ovoglobulin stimulation.Immunohis-tochemically positive cells lay in the plasma of airway epithe-lium，in cell nucleus of bronchial epithelium and in inflamma-tory cells.Pathologic studies showed smooth muscle thick-ened around bronc
6、hia and lymphocyte infiltration under mu-cosa or around bronchia smooth muscle.CONCLUSION Proto-oncogenes expression plays an important role in the process of asthma airway 3remodeling. 0 引言 气道重塑（Airway remodeling）是支气管哮喘的重要病理特征之一，是哮喘长期反复发作的结果.许多因素如炎症介质、细胞因子及原癌基因都参与了这一过程.气道重塑是气道狭窄的重要原因，慢性气道炎症与气道重塑及气道
7、高反应性的发生关系极为密切.原癌基因是生物体内的一类高度保守基因，控制细胞的生长和分化，同时参与炎症的发生.本研究通过检测豚鼠哮喘模型气道 c-fos，c-jun及 Fos，Jun，Myc，Sis 的表达，以探讨它们与气道重塑的关系. 1 材料和方法 1.1 材料 盐酸胍、SDS 购自美国 Sigma 公司， -32 PdATP 为北京福瑞公司产品，缺口平移标记盒为 BRI 公司产品，c-fos，c-myc 质粒及 Fos，Myc 蛋白抗体由本校解剖教研室提供，Jun 多克隆抗体购自北京中山生物技术公司，Sis 抗体购自 Santa Cruz 公司. 1.2 动物及标本制作 正常成年雄性豚鼠（
8、本校实验动物中心提供）40 只，体质量 300400g ，随机分为实验组（20 只）和对4照组（20 只） ，实验组用 100g L-1 的卵蛋白生理盐水 ip 致敏，2wk 后用 10g L-1 卵蛋白生理盐水雾化激发，隔日 1 次，共 10 次.对照组用同样方法致敏，以生理盐水代替 10g L-1 卵蛋白盐水雾化吸入，余同实验组.于最后 1 次诱发试验后 35h 用 10g L-1 戊巴比妥钠经腹腔麻醉处死动物，以 100mL 冷生理盐水经右心室快速冲洗，再以 300mL40g L-1 多聚甲醛缓慢灌注，固定 40min，取气管、不同部位支气管置于同一固定液中固定 12h，随之浸泡于4，2
9、00g L-1 蔗糖液内，于 -20制备 40m 厚片和 15m 的邻片. 1.3 总 RNA 的提取 放血处死动物，立即剥离气道及肺组织，置-70冰箱冻存，异硫氰酸胍- 饱和酚-氯仿法提取总 RNA1 . 1.4 气道及肺组织 cfos，cmyc mRNA 的测定 用含 c-fos 和 c-myc 的 cDNA 质粒，按 Sambrook 等2 方法转染细菌，扩增制备质粒，相应内切酶酶切后用低融点琼脂糖法回收cDNA 片段， 32 P-dATP 缺口平移法分别标记 fos 和 myc 基因 cDNA 探针片段，然后进行 RNA 斑点杂交和 Northern 杂交. 1.5 Fos 和 Myc
10、 蛋白的免疫组化染色 ABC 法按序 PBS 漂洗组织切片，以 30mL L-1 羊血清 1 200 稀释一抗，二抗以 1 200 稀释，孵育 1h，经 PBS，Tris-HCl 缓冲液充分漂洗，DAB 显色，5Mayer 苏木精复染 2min.以 10mmol L-1 磷酸盐缓冲液、正常羊及兔血清取代第一抗体行空白对照与替代对照. 1.6 Jun 蛋白免疫组织化学染色 按 ABC 法进行，40m 厚切片置入含 3mL L-1 H2 O2 的甲醇溶液（800mL L -1 甲醇配制）30min ，加入含 1mL L-1 Triton X-100 的绵羊抗Jun 血清（ 1 400，10mmol
11、 L-1 PBS pH7.27.4 配制） ，37孵育 30min，4孵育 48h，加入生物素化兔抗绵羊 IgG（1 300， 10mmol L-1 PBS 配制） ，4孵育 24h，置入 Strept-Avidin-HRP（1 300，10mmol L-1 PBS 配制） ，室温下孵育23h.用含 0.5g L-1 DAB 和 0.1mL L-1 H2 O2 的 50mmol L-1 Tris 缓冲液（ pH7.6）呈色. 空白对照与替代对照同前 . 1.7 Sis 蛋白免疫组织化学染色 切片水化后入 3mL L-1 H2 O2 甲醛液中孵育 20min，3mol L-1 尿素消化 30mi
12、n，加入兔抗人 Sis 多克隆抗体（工作浓度 1 100） ， 4过夜，次日 37 复温1h，生物素化羊抗兔 IgG（工作浓度 1 200）37 孵育40min，ABC 复合物（工作浓度 1:100）37孵育 30min，DAB显色. 空白对照与替代对照同前. 2 结果 62.1 病理结果 经过 10 次激发实验后，豚鼠气道上皮水肿、脱落明显，气道平滑肌显著增生，平滑肌下层亦有明显增厚、水肿.激发实验 4h 后，气道粘膜及小支气管平滑肌周围有少量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及 中性粒细胞浸润，1224h 后上述细胞浸润加重，粘膜下层及粘膜上皮内以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞为主. 2.2 Dotbolt
13、 与 Northernblot 分子杂交结果 正常豚鼠气道上皮可见 c-fos mRNA 和 c-myc mRNA 低水平表达，哮喘发作后，气道 c-fos mRNA 和 c-myc mRNA 的表达明显增强，30min达高峰并持续至 120min，240min 时其表达水平接近正常.Dot-blot 与 Northern-blot 杂交的结果一致. 2.3 Fos，Myc 免疫组化染色结果 Fos，Myc 阳性反应的细胞可见棕黑色颗粒，在气管主要分布于气道上皮细胞胞质及气道上皮层的游离缘，在小支气管则分布于上皮下间质（Fig1，2） ，平滑肌细胞及肺间质仅有少量反应，实验组的阳性颗粒数目明显
14、高于对照组. 2.4 Jun 免疫组化染色结果 Jun 蛋白呈深褐色，主要分布于气管、支气管及细支气管的上皮细胞核中（Fig3） ，成纤维细胞、血管内皮细胞及炎症细胞可见少量阳性表达，其阳性颗粒呈致密排布.正常对照组气管及支气管上皮细胞无或只有极少数有阳性颗粒. 2.5 7Sis 免疫组化染色结果 实验组动物气道壁及周围组织中可见大量 Sis阳性反应细胞，阳性细胞主要为气道粘膜上皮细胞及浸润的炎症细胞（Fig4）. 对照组动物气道无 Sis 阳性反应细胞. 3 讨论 气道重塑是指由于支气管哮喘反复发作而导致的气道壁重新塑形. 气道炎症细胞释放的炎症介质及细胞因子所致的气道平滑肌及间质细胞增生是
15、气道重塑的重要原因.近年来的研究表明，原癌基因几乎参与信号传递通路的每个环节3，4 ，各种刺激如神经递质、激素、炎性介质等在数分钟内即可引起该类基因的表达，原癌基因的表达可加速细胞因子及炎症介质的表达与释放，促进细胞的增殖与分化，增加细胞对炎症介质的敏感性5 .因此原癌基因的表达对气道炎症的发生及气道重塑有重要作用. 实验表明组织胺、IL-1，TNF 及内皮素等多种因素参与了气道重塑，各种炎症因子如外源性抗原、5-HT 等均可迅速导致原癌基因的表达6 ，而其蛋白表达产物如 Jun，Fos 可形成 AP-1，可促进多种细胞因子的表达，其中 IL-2 的表达可激活 Ts，Th 淋巴细胞，并诱导更多
16、的细胞因子表达，如 TNF-，IL-4 ，IL-8 等，AP-1还可诱导 IL-5 的表达， IL-5 不仅可以促进细胞合成免疫球蛋白，还可趋化嗜酸性粒细胞，延长嗜酸性粒细胞存活时间，并诱导嗜酸性8粒细胞分化7 ，而嗜酸性粒细胞的增多在过敏性哮喘的发病中有重 要作用. 图 1 图 4 略 实验表明，实验动物在哮喘发作后短期内即有 c-fos 及 c-myc mRNA 的表达，说明 c-fos，c-myc 的表达是哮喘发作后的早期事件之一，c-fos，c-myc 基因的过量表达可导致多种炎症介质的释放，这是气道重塑的重要原因.阻断 c-fos 基因的表达，对于哮喘患者气道重塑及哮喘症状的控制有积极的意义.Lane 等8 更进一步的研究发现，激素抵抗的哮喘患者其外周血 c-fos 的表达率、mRNA 的翻译和其蛋白产物的表达水平较激素敏感组更高，说明 c-fos 的高度表达不仅可以增加 AP-1 的水
