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1、实验一 消毒与灭菌一、 实验实训目的了解高压蒸汽灭菌的原理、使用范围和注意事项。熟悉高压锅和干燥箱的构造，掌握高压蒸汽灭菌、烘烤灭菌的方法，学会培养皿及吸管的包扎。二、 实验实训材料高压蒸汽灭菌锅，恒温干燥箱，待灭菌的培养基，培养皿、长棍条等。三、 实验实训内容和方法(一)高压蒸汽灭菌1.高压锅的构造 实验室常用的是手提式高压锅，其构造一般分为外锅、内锅、和锅盖。外锅是装水的厚锅桶，内锅是放置待灭菌物品的薄锅桶，内锅壁上有一壁管，是插入排气管用的。锅盖上有压力表（显示锅内蒸汽压力值和锅内温度） 、排气阀（下端连接排气管，排除锅内冷空气）和安全阀（自动放出超额压力，避免高压锅爆炸） 。2.高压锅
2、的使用步骤 高压锅的使用步骤一般分为装锅、加热排气、升压、保压和降压。 （1）装锅 手提式高压蒸汽灭菌锅可向外锅注入适量水分。放入内锅，将待灭菌的培养基或其它物品疏松摆放其内，盖上锅盖，对角线式拧紧锅盖上的螺旋。（2）加热排气 用电源或其它热源加热。打开排气阀，待大量热蒸汽冒出约 2min，以完全排净冷空气后再将其关闭。（3）升压 排气后关闭排气阀，使高压锅处于密闭状态，随着热蒸汽的不断增多，锅内蒸气压也随之加大，温度逐渐上升，直至压力达到所需压力。升压要缓而稳，不能忽快忽慢甚至降压。（4）保压 待压力升至所需的压力时，开始计算灭菌时间。调节热源维持恒压直至完成灭菌时间。一般培养基需在 103
3、kPa 压力下，维持 30min 左右。不同物品应采用不同的压力和时间，保压过程中要不断调节热源，使压力始终维持在所需压力值上，不能升降幅度过大。（5）降压 完成灭菌时间后关闭热源，压力徐徐下降，一定要待压力自然下降至“0”时才能打开排气阀和锅盖，降压过急会导致培养基喷出或玻璃器皿破裂。若待灭菌的物品是培养基，应将锅盖略打开，让热气将棉塞或包扎纸烘干。（6）出锅 灭菌物品若是培养基，可在温度降至 60时将其取出，随即把试管中的培养基摆成斜面。将试管斜置于棍条上，以斜面长度约为试管长的 1/2 为宜。若气温较低，可在试管上覆盖毛巾等物品，以防止降温太快使试管中形成大量的冷凝水，不利于菌种的成活。
4、若装培养基的容器是三角瓶，可将其倒入无菌培养皿中，形成平板培养基。高压锅中的灭菌物品被取出后应随即将外锅中的水倒出。锅盖不要盖严，以利于锅内保持干燥和延长锅盖上下密封圈的使用时间。(二)烘烤灭菌1.培养皿和吸管的包扎制平板培养基时用的培养皿和菌种分离时用的吸管都要经包扎后进行严格的灭菌。培养皿一般 5 或 10 套为一包，用双层报纸包。吸管在包扎前，应在管口塞入长约 1cm 的棉花，以防止菌液吸入口中或口中菌体进入管内。然后将吸管尖端放在 45cm 宽的长纸条的一端，使其与纸条呈 45角卷叠纸条，直至将吸管全部包卷，末端多余的纸条打结，最后再将吸管集中包扎成捆。玻璃刮铲的包扎同吸管一样，也要逐
5、个用报纸包裹。2.恒温干燥箱的使用方法利用恒温干燥箱进行烘烤灭菌的步骤大致为装箱、加热排气、升温、保温灭菌和降温开箱。(1)装箱 将包装好的培养皿、吸管等耐烤的物品均匀放入箱内，关闭箱门。(2)加热排气 接通电源，开启干燥箱上的开关，打开箱顶排气孔以排除水汽。若配有鼓风设备，可同时打开鼓风机，以加速干燥。待灭菌温度升至 100105进关闭排气孔。(3)升温 关闭排气孔上继续加热，温度继续上升直至灭菌所需温度。(4)保温 当温度上升至 160170时，计算灭菌时间，控制温度调节器，维持温度2h 后关闭电源。(5)降温 2h 结束后，让温度自然下降，必须等箱温下降至 60以下时方能打开箱门，取出灭菌物品，以免导致玻璃器皿爆裂。用烘烤法进行灭菌时，除注意箱温勿超过 180外，还不能用油纸或蜡纸包扎被灭菌物品。四、实验实训报告写出高压蒸汽灭菌和烘烤灭菌的操作过程。五、思考题1.高压锅的构造如何？安全阀和排气阀各有何作用？2.高压锅在使用中应注意哪些问题？3.干燥箱在使用中有哪些注意事项？
