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1、1几类实体肿瘤对 IFN 2a 治疗敏感性与其细胞表面受体表达的关系作者：刘艳，韩苇，颜真，张英起 【摘要 】 目的： 探讨肿瘤细胞表面干扰素 受体的表达与其肿瘤对 IFN 2a 治疗敏感性之间的关系 . 为建立干扰素 敏感肿瘤的快速评价方法奠定基础. 方法： MTT 法体外筛选 IFN 2a 敏感与抗性肿瘤细胞株，选取人肺腺癌细胞A549，SPCA1 ，GLC82 和人低分化胃腺癌细胞 MKN45 共4 株细胞；通过构建荷瘤裸鼠模型，证实不同肿瘤对干扰素治疗的敏感性存在差异. 流式细胞术、免疫组织化学、Western Blot 检测肿瘤细胞表面 IFN 受体的表达差异. 结果： 体内、体外实
2、验结果表明:A549，SPCA1 为 IFN 2a 敏感性细胞株，MKN45，GLC82 为 IFN 2a 抗性细胞株 . 细胞和组织水平检测的结果表明：表达量由高到低依次为A549，SPCA1 ，MKN45 ，GLC82. 结论： IFN 受体表达的高低与肿瘤细胞对干扰素的敏感性具有密切的相关性，对实现有针对性的个体化治疗具有一定的指导意义. 【关键词】 干扰素 ；受体,干扰素 ；敏感性与特异性2【Abstract】AIM： To explore the relationship between interferon receptor expression on tumor cell sur
3、face and tumor sensitivity to IFN 2a treatment so as to develop a new method for quick identification of IFN sensitive tumors. METHODS： MTT assay was adopted to differentiate the sensitive and resistant cell lines to IFN. We chose four cell lines, human lung adenocarcinoma (A549, SPCA1, GLC82) and p
4、oorly differentiated human stomach adenocarcinoma cell cine (MKN45) to establish tumorbearing mice, and to further detect the sensitivity difference to IFN 2a. Then the expression difference of interferon receptor (IFNAR) was determined by flow cytometry, immunohistochemistry and westernblot. RESULT
5、S: Data in vivo and in vitro indicated that A549 and SPCA1 were cell lines sensitive to IFN 2a and MKN45 and GLC82 were ones resistant to IFN 2a. The expression of IFNAR on A549, SPCA1, MKN45, GLC82 was decreased in a stepwise manner. CONCLUSION: The sensitivity of solid tumor to IFN therapy is clos
6、ely related with the IFNAR expression on tumor cell surface, and this result might be helpful for the realization of individualized 3therapy.【Keywords】 interferonalpha； receptors, interferon；sensitivity and specificity0 引言干扰素作为最早发现、首个克隆化并应用于临床治疗疾病的细胞因子，主要通过诱导一系列细胞效应蛋白表达而发挥抗病毒、抗肿瘤和调节免疫应答的作用1. 目前除了用于慢
7、性乙型、丙型肝炎的抗病毒治疗，在肿瘤治疗方面的应用价值也已得到肯定. 但由于其具体的分子生物学机制尚不十分清楚，所以在肿瘤的临床治疗中存在很多问题，部分肿瘤经干扰素治疗后具有良好的效果，但很多肿瘤对干扰素的治疗并不敏感，并易产生毒副作用，这在很大程度上限制了干扰素在临床的广泛应用2. 我们通过探究不同细胞对干扰素治疗敏感性差异的原因，为实现针对性较强的个体化治疗奠定基础.1 材料和方法1.1 材料4人肺腺癌细胞系 A549，SPCA1 ，GLC82 和人低分化胃腺癌细胞系 MKN45 均由第四军医大学生物制药学教研室保存. RPMI1640（美国 Gibco） ；小牛血清（FCS，杭州四季青）
8、 ；IFN 2a（瑞士 Roche） ；MTT（Amresco） ；鼠抗人干扰素 /受体 mAb（Chemicon 公司） ；actin mAb（Cell signaling） ；HRP 标记山羊抗小鼠二抗、DAB 显色试剂盒（北京中杉） ；裸小鼠(BALB/c nu/nu)，雄性, 90 只，4 6 wk 龄, 体质量 1820 g（第四军医大学实验动物中心） ；即用型快速免疫组化 MaxVision 试剂盒（福州迈新生物） ；流式细胞仪（美国 Becton Dickinson） ；550型酶标仪(美国 BioRad).1.2 方法1.2.1IFN 2a 的抗细胞增殖作用 MTT 法，取细胞
9、悬液，5103 个/孔接种于 96 孔板中，每孔 100 L, 37 ，50 mL/L CO2 培养 6 h 后取出，弃培养液，分别加入药物终浓度为5104，1105，5105，1106，5106 U/L 的 1640 培养液，每孔 100 L, 每组 3 个复孔，对照组仅加培养液，孵育 48 h，加 5 g/L MTT 液 20 L，4 h 后弃上清，加二甲基亚砜 (DMSO) 100 L，室温振荡 10 min，酶标仪测定 A490 nm. 细胞抑制率（%）= 1-(实验组 A490 nm/对照组 A490 nm)100%.51.2.2 抑瘤实验取浓度为 11011 个/L 的细胞悬液 0
10、.1 mL, 于裸鼠背部皮下接种，待肿瘤直径长至 4 mm 以上时，淘汰肿瘤体积过大、过小的裸鼠，将合格动物随机分为对照组、干扰素低剂量治疗组（3106 U/kg）和高剂量治疗组（ 9106 U/kg） ，每组 6只. 随后肌肉内注射治疗，1 次/d, 对照组为生理盐水. 每 34 d用 1/50 mm 精度游标卡尺测肿瘤的长径和短径，按下式计算肿瘤体积. 肿瘤体积(mm3)= 肿瘤长径(mm)肿瘤短径（mm）20.52. 末次给药后次日称体质量，处死动物，解剖剥离瘤块称瘤质量，计算抑瘤率. 抑瘤率（肿瘤生长抑制率）= 对照组平均瘤质量给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量100%.1.2.3 流
11、式细胞术检测 IFN 受体制备细胞悬液，3105 个细胞移入小离心管，正常山羊血清封闭（120 稀释）, 0.1 mg/L IFNAR mAb 20 L，4 孵育 30 min, 离心，5 L 工作浓度的FITC 标记的山羊抗小鼠二抗，4 ，30 min，离心，加入 500 L固定液，流式细胞仪检测. 实验时设同型对照组.1.2.4 肿瘤组织冰冻切片的制备取 4 株细胞的荷瘤裸鼠，处死后剥离瘤组织置于-80保存，切片时将瘤块放在标本座上，包埋剂OCT 包埋，冰冻切片机切片，将平整的切片贴附在处理好的载玻片上，稍风干后置于冷丙酮中固定 2530 min, 置于标本盒中-80待用.61.2.5 免
12、疫组化检测表面受体分布冰冻切片经 H2O2 封闭内源性过氧化物酶，2 mg/L 鼠抗人 IFNAR mAb，湿盒中 4过夜；适量即用型快速免疫组化 MaxVision 试剂，室温 1015 min，DAB 显色 5 min，苏木精衬染，封片，显微镜下观察拍照. 以 PBS 替代一抗作阴性对照.1.2.6Western Blot 检测 IFNAR 的蛋白表达水平参照分子克隆方法提取 4 株细胞总蛋白， Lowrys 法蛋白定量，SDSPAGE电泳分离后将凝胶中蛋白质湿转法移至 NC 膜上，封闭，稀释的IFNAR mAb（11000） ，4 过夜，工作浓度的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗
13、，室温 1 h， ECL 发光显色液显色，暗室中 X 光片曝光. 每步洗膜用 TBST 洗 3 次，5 min/次.统计学处理：用 SPSS11.0 统计软件，数据以 xs 表示，统计分析方法采用 LSDt 检验，以 P0.05 为具有统计学差异.2 结果2.1IFN 2a 对细胞生长的影响随 IFN 2a 药物浓度的增加，对细胞的抑制率呈增强趋势，当浓度1106 U/L 时，对A549 细胞的抑制作用最强, 其次是 SPCA1 细胞，与对照组比较均有统计学差异（P0.05，图 1)；对 MKN45，GLC82 细胞的7抑制与对照组比较无统计学差异.2.2 抑瘤实验经高、低剂量组 IFN 2a
14、 药物治疗 2832 d后，干扰素明显抑制 A549 细胞裸鼠移植瘤的生长，作用呈剂量依赖性，与对照组比较具有统计学差异（P0.05） ，高、低剂量组的最大抑瘤率分别为 76.0% 和 57.4%；干扰素也可抑制 SPCA1细胞裸鼠移植瘤的生长，与对照组比较具有统计学差异（P0.05） ，高、低剂量组的最大抑瘤率分别为 72.6% 和 34.4%；高剂量干扰素对 MKN45 和 GLC82 细胞裸鼠移植瘤无明显抑制作用，与对照组比较无统计学差异（图 2）.2.3 流式细胞术检测 IFN 2a 受体分布肿瘤细胞表面IFNAR 的表达具有明显差异，A549 细胞表面表达较高, 其次为SPCA1，M
15、KN45 ，GLC82. 表达率分别为（ 53.55.8）%， （43.64.4 ）% ， （3.70.6）%， （2.00.2）%.2.4 荷瘤小鼠肿瘤组织的免疫组化接种 A549 细胞株的荷瘤小鼠肿瘤组织细胞可见明显的 IFNAR 膜表达；接种 SPCA1 细胞株的表达略少于 A549；接种 MKN45，GLC82 细胞株的几乎没有 IFNAR 表达（图 3）.2.5 体外检测 4 种细胞 IFNAR 蛋白的表达差异以 actin 为8内参照，4 种细胞的 IFNAR 蛋白水平的表达与以上实验结果一致，从 A549 到 GLC82，IFNAR 的表达量依次降低（图 4）.3 讨论干扰素 2a 被批准用于抗肿瘤治疗 20 多年来已显示有效的抗肿瘤作用, 对毛细胞白血病、慢性髓样白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、胃肠道肿瘤、恶性黑色素瘤等多种肿瘤具有良好疗效3. 但也有许多肿瘤对干扰素的治疗并不敏感，如 253J BV IFN（R）(膀胱癌细胞) 、MM96（黑色素瘤细胞） 、KM12L4 IFN(R)(结肠癌细胞)等就属于干扰素抗性肿瘤细胞2. 所以发现影响肿瘤对干扰素治疗敏感性的关键分子，就能通过及时检测患者的肿瘤组织细胞是否高表达这一分子而判断该肿瘤是否属于干扰素敏感肿瘤，从而有针对性地进行治疗，减少用药的盲目性，增加患者的生存率或改善
