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1、1凝血酶及其抑制剂在中枢神经系统的作用作者：杨丽娟 赵冬梅 邬力祥 【关键词】 凝血酶 【关键词】凝血酶；凝血酶受体；PN- 1；中枢神经系统；缺血缺氧 越来越多的研究表明，凝血酶在神经系统正常发育和病理状态下发挥重要作用。凝血酶及其抑制物在脑软组织伤和脑脊液流速改变后进入血脑屏障增多。在发育的大脑或成人脑内凝血酶原和他们的受体局限于几个特定的区域。凝血酶具有毒性作用，包括在体外引起不同神经元和非神经细胞突触回缩、死亡。这些作用可通过细胞表面的受体调节，而且能被特异的丝氨酸蛋白酶抑制剂阻断。最近研究显示，应用 PN- 1 治疗能提高脊髓运动神经元凋亡的存活率，促进遂后损伤的修复。小剂量凝血酶(
2、12 u/ml)能保护神经元和胶质细胞免受低血糖、缺血缺氧等损伤引起的细胞死亡 。用小剂量凝血酶预处理可明显减轻遂后脑内注射大剂量凝血酶引起的脑水肿、脑缺血的程度，若同时给以等剂量的水蛭素，则保护作用减弱。资料显示凝血酶在大剂量时发挥毒性作用而小剂量则具有保护作用 ，现就凝血酶及其抑制剂在中枢神经系统的作用作一综述。 1 凝血酶及其受体的生物特性 1.1 凝血酶及其抑制剂的特性 21.1.1 凝血酶的特性：凝血酶是丝氨酸蛋白酶家族中重要的成员。分子量 36 kD，由 A、B 两条链组成。两链间以二硫键相连。A 链由 36 个氨基酸残基组成。B 链是其主要部分，由 259 个氨基酸残基组成。在人
3、类，凝血酶原基因位于 11 号染色体，含 14 个外显子，13 个内含子3 。凝血酶原在肝脏翻译修饰，成熟后以 72 kD 的酶原形式分泌。凝血酶的主要功能是激活纤溶酶原成为活性纤溶酶。除了在凝血和纤溶过程中发挥重要作用外，凝血酶还参与肿瘤浸润、炎症、卵母细胞成熟和细胞迁移。此外，凝血酶还参与神经轴突生长，刺激 样淀粉酶合成，诱导神经母细胞瘤 cGMP 形成，刺激培养的星形胶质细胞分泌神经营养因子增多，而且，可使神经胶质细胞增殖，形态改变 。长期以来，人们认为凝血酶原只在肝脏合成，但最近 PCR、 Northern 印迹、原位杂交技术显示凝血酶原在发育中的鼠和成年鼠脑内也有表达。在初生鼠脑内凝
4、血酶原表达很低，到成年后显著升高，凝血酶原在嗅球、大脑皮层、上丘、下丘、纹状体、脑室均有表达 。凝血酶原/凝血酶在中枢神经系统发挥重要作用。新陈代谢或物理损伤可使凝血酶原转化成有活性的凝血酶 。据报道，外伤性脑损伤 、脑缺血和脊髓损伤可导致凝血酶水平升高 。 1.1.2 凝血酶抑制剂在脑内的表达：脑内的凝血酶抑制剂主要有两种，PN- 1 和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI- 1)。PN- 1 分子量 43 kD，是脑内重要的凝血酶抑制剂，定居于毛细血管和大血管周围，在神经元、星形胶质细胞和微小血管平滑肌细胞均有表达，PN- 13可调节凝血酶引起的细胞增殖和形态改变，高浓度时也可抑制纤溶酶原激活物的
5、活性，研究认为其可能通过防止凝血酶在脑血管损伤或病理条件下渗透入脑组织发挥保护作用。在脑缺血和脊髓损伤后可观察到 PN- 1 的延迟性升高 。PAI- 1 通过抑制凝血酶原向凝血酶的转化抑制凝血酶的产生，但其在中枢神经系统的作用较弱。此外，在脑缺血或脑出血等疾病时脑内有 HSP47 表达，HSP47 可通过改变细胞外基质成分抑制凝血酶作用 。 1.2 凝血酶受体的特性 Northern blot 和原位杂交技术显示凝血酶受体 mRNA 分布于全脑和脊髓背根神经节。脑部定位显示凝血酶受体表达最多的部位在新皮层、扣带回、 海马下脚、视丘下部、小脑和嗅球 。这些受体在神经细胞和非神经细胞都有表达 。
6、凝血酶受体(TR)属于蛋白酶激活受体(PAR)家族，最早发现的凝血酶受体命名为 PAR1，PAR1mRNA 在中枢神经系统中广泛表达,包括大鼠星形细胞和脑毛细血管内皮细胞、小胶质细胞、星形胶质瘤细胞、神经元和鸟脊髓运动神经元 ，脑内主要表达于海马、皮质和扁桃体等部位。PAR2 和 PAR3 高表达于海马、皮质、扁桃体、丘脑、下丘和纹状体。PAR4 与 PAR2 和 PAR3 表达类似，只是在纹状体不表达 。不像传统的生长因子如EGF、 PDGF 直接激活细胞表面的络氨酸激酶受体，凝血酶激活 G蛋白耦连受体。凝血酶受体有 7 个疏水的螺旋状跨膜区域 ,形成 3 个胞外环状结构和 3 个胞内环状结
7、构。胞外 N 端在第 1 个穿膜区之前大约有 100 个氨基酸,其中紧靠 41 位精氨酸的 N 端序列与凝血酶识4别切割位点有关;与水蛭素的 C 端具有同源性的 TR5364 序列, 既可与凝血酶活性位点结合，也可与其阴离子结合位点结合 。凝血酶与上述 2 个序列相互作用，在 PAR1 的 41 位与 42 位间通过蛋白水解作用使其分裂,产生一个新的称为”栓系配体”的 N 末端,与受体胞外第 2 个环和靠近第 1 穿膜区 N 端的结合位点起作用,产生跨膜信号传递 。受体激活刺激第二信使如 cAMP 和Ca2+，进而调节蛋白激酶活动。在细胞研究发现,凝血酶可激活PLC、 PLA、PKC 、MAP
8、K 、络氨酸激酶和腺苷酸环化酶。主要通过以下途径：凝血酶激活 PLC 形成 IP3 和 DAG，IP3 激活一方面使细胞膜上钙通道开放，Ca2+ 内流增加；同时开放细胞内钙池，Ca2+释放增加。胞内 Ca2+浓度升高。PLC 抑制剂、内质网 Ca2+抑制剂、钙通道阻制剂和胞外 Ca2+降低均可使培养的脑微血管内皮细胞内 Ca2+升高幅度降低 。说明凝血酶通过影响 Ca2+跨膜内流和钙池的释放引起胞内 Ca2+升高。 DAG 和 Ca2+激活PKC，引起核转录因子活化和转位。激活 MAPK 激酶，促进细胞增殖 。由 PLC- IP3/Ca2+- PKC 或 IP3 途径激活 MAPK 系统。MA
9、PK 磷酸化激活细胞内 PLA2，PLA2 诱导花生四烯酸释放和前列腺素及白三烯合成，这一系列反应对于调节血管通透性和血管平滑肌细胞增殖是非常必要的。然而，这一系列反应在神经系统可导致神经细胞死亡。前列腺素导致血小板聚集，血管收缩，引起组织缺血、细胞死亡。而花生四烯酸可引起膜破裂，细胞破坏 。52 凝血酶及其抑制剂在神经系统的作用 凝血酶可使蛋白水解激活，可抑制几种无血清培养细胞的长期形态分化，包括脊索和脑内的神经元、成神经瘤细胞、星形胶质细胞和神经上皮细胞。星形胶质细胞对维持脑的正常生理功能是非常重要的 ，包括维持离子平衡，调节神经递质浓度，抗氧化，参与信息传递。还有关于成熟神经胶质细胞形成
10、胶质网络限定脉管系统，并深入脑膜参与脑出血控制的报道 。星形胶质细胞也合成和分泌神经营养因子，为不同神经细胞生长提供营养。星形胶质细胞与神经元联系依赖星状突起，改变突起可以干扰星形胶质细胞与神经元的联系。如果星形胶质细胞培养在含血清或凝血酶的介质中，其周围的突起就会改变，增加凝血酶浓度将使培养的细胞突起减少、回缩、细胞变圆，加入凝血酶抑制剂这些作用将被阻断或逆转。加入凝血酶后的作用发生迅速，在加入后几分钟就有作用，而加入抑制剂后需要几个小时才能恢复 。总的来说，凝血酶如不被其抑制剂阻断，可消弱星形胶质细胞与周围环境联系的能力，星形胶质细胞参与血脑屏障处紧密连接的形成，凝血酶将破坏星形胶质细胞形
11、态,导致血脑屏障的破坏。凝血酶还可通过降解细胞外基质成分抑制神经元分化，Jalink 和 Moolenaar 的实验分别显示,凝血酶可使神经瘤细胞 N1E- 115 和 NG108- 15 变圆，轴突回缩 。加凝血酶受体激活肽段到无血清的 N1E- 115 或 NG108- 15 成神经瘤细胞内，也可引起锥体细胞的快速崩溃、突触回缩、神经细胞变圆。Lucren 等实验研究显示凝血酶抑制培养的鸡脊髓运6动神经元突触生长，诱导细胞死亡，加入 PN- 1 能使鸡的脊髓运动神经元免于死亡,其效应是剂量依赖性的。凝血酶的毒性效应在预先或同时给予凝血酶抑制剂水蛭素时可被抑制。凝血酶处理后的几小时内可诱导运
12、动神经元死亡，引起 DNA 裂解，细胞凋亡 。这些研究均说明了凝血酶的毒性作用；而 PN- 1 则具有保护作用。然而，新的研究证实，凝血酶在低浓度(12 u/ml)时可对抗缺血缺氧和低血糖引起的细胞凋亡 。小剂量凝血酶预处理可明显减轻随后脑内注射大剂量凝血酶引起的脑水肿、脑缺血的程度，若同时给以等剂量的水蛭素，则保护作用减弱。如上所述，凝血酶在高浓度时有毒性作用，而低浓度则具有保护作用，以上作用可被凝血酶抑制剂阻断；凝血酶和其抑制剂之间的平衡对神经细胞的正常发育具有重要作用。 3 凝血酶及其抑制剂在神经病理发生时的变化 脑内存在凝血酶及其受体，在病理情况下内源性凝血酶可被激活；脑内脉管系统的形
13、态和生理功能异常，如脑外伤、血管瘤破裂、脑梗死等疾病时血脑屏障破坏，血浆来源的凝血酶可以进入胶质细胞和神经元周围。凝血酶增加的同时也伴随着其抑制剂 PN- 1 的变化。研究认为，凝血酶和其抑制剂之间存在拮抗作用，共同调节组织细胞损伤的程度。凝血酶可提高培养的单层内皮细胞对白蛋白的通透性，提示凝血酶可提高神经系统局部的通透性。在凝血酶作用下各种分子游出血管的通过率提高，并进入神经元生长的空间，使神经元易受攻击。同时凝血酶自身在神经元和胶质细胞周围可引起神经7元和胶质细胞突触回缩、死亡，胶质瘢痕形成。高水平的凝血酶局限于阿尔茨海默病（AD）病人衰老脑片，对 AD 病人尸解，采用免疫组化技术研究发现
14、，病人脑室和血管周围的 PN- 1 表达较对照组显著降低，表现在 PN- 1 活力降低和蛋白表达减少两方面，其降低是因为 PN- 1 与升高的凝血酶结合。推测凝血酶和其抑制剂 PN- 1之间的平衡失调参与 AD 的发生 。雌激素可诱导 PN- 1 分泌，调节丝氨酸蛋白酶平衡，临床上应用雌激素治疗 AD 病人。对海马脑片培养研究显示，脑缺血后，凝血酶原表达升高，而 PAR和 PN- 1 表达未见变化。应用 RT- PCR 技术发现，大鼠短暂的脑缺血后出现凝血酶原表达上调，PAR1- 3 变化无显著意义， PN- 1 未见变化 。但是 2001 年，Striggow 等的研究显示，严重缺血后海马区
15、四种 PAR 表达均升高 。对沙土鼠四动脉结扎缺血模型的研究发现，PN- 1 表达上调持续1 年以上 。由上述研究推测凝血酶、PAR 和 PN- 1 的表达变化和缺血形式、损伤程度有关。此外在脊髓损伤、脑外伤等疾病也有凝血酶、PAR 和 PN- 1 表达升高的报道。虽然这些蛋白酶在神经系统的具体作用和作用机制还不太清楚，但可以肯定凝血酶、凝血酶受体和其抑制剂参与了神经系统疾病的发生和随后的损伤。 总的来说，越来越多的事实证明凝血酶和其抑制剂与神经系统的发展、可塑性形成和病理疾病发生密切相关。除了参与神经形成和突触可塑性改变，这些蛋白酶还可能在神经系统损伤如阿尔茨海默病、脑出血、脑缺血等疾病中发
16、挥重要作用。进一步阐明其在神经8系统的作用是非常必要的。了解凝血酶、凝血酶受体和其抑制剂在神经系统的功能将有助于阻止脑血管疾病导致的细胞死亡，将有助于其治疗策略的发展、改进。 （第一作者杨丽娟为中南大湘雅医学院在读硕士研究生） 参考文献 1. Striggow F，Riek M，Breder J，et al. The protease thrombin is an endogenous mediator of hippocampal neuroprotection at high concentrationsJ .Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 2264 2. Masada T，Xi G，Hua Y，et al.The effects of thro
