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1、1冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株 CNE2细胞的放射增敏作用【关键词】 冬凌草甲素 鼻咽肿瘤 放射增敏A ABSTRACT Objective: To observe the radiosensitization of Oridonin and its mechanism on nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2. Methods： The radiation sensitization enhancement ratio（SER） was determined by clonogenic assay. Cell cycle distribution w
2、as assessed by flow cytometry. Results： The SER was 1.227. The rate of G2/M phase block related to the Oridonin group, the radiotherapy group and the combination treatment group was 17.8%, 24.7% and 45.2%, respectively. Conclusion： Oridonin can enhance radiosensitition for CNE2 cells, which maybe re
3、late a to changes of the cell cycle. KEY WORDS Oridonin； Nasopharyngeal carcinoma； Radiosensitization 鼻咽癌是我国南方最常见的头颈2部恶性肿瘤之一，病理类型以低分化鳞状细胞癌多见，临床治疗以放疗为主，晚期患者辅以化疗。与传统的化疗药物相比，天然抗肿瘤药物日益受到人们的关注1 。我们先前的研究表明，冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株 CNE2 细胞具有明显的抑制作用 2 ，但对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响如何？本实验将冬凌草甲素联合放疗应用于人鼻咽癌细胞株 CNE2 细胞，通过克隆形成实验、流式细胞分析等
4、观察冬凌草甲素的放射增敏作用及其可能机制，以期为临床应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 细胞株、药物和试剂 人鼻咽癌细胞株 CNE2 细胞购于中国科学院上海细胞生物所，冬凌草甲素（纯度98%）购于中国科学院昆明植物研究所，PI（碘化丙啶）购于 Sigma 公司，流式细胞仪为 Beckman Coulter 公司产。1.2 细胞培养 细胞培养基 RPMI1640（美国 Gibco BRL 公司） ，补充 10%胎牛血清（杭州四季青公司） 、100?IU/ml 青霉素和0.1?mg/ml 链霉素。置于 37?、5%CO2 培养箱在全湿条件下培养。1.3 照射条件 使用 6MV X 线直线加速器
5、照射，照射距离为3100?cm，照射野为 10?cm10?cm 大，室温下单次照射。1.4 克隆形成实验测定药物放射增敏性 分为单纯照射组和药物+照射组，后者在照射前予以冬凌草甲素 100?mol/L，培养箱内培养 24?h。照射剂量分别为 0、2 、4、6、8、10?Gy 。胰酶消化，计数细胞数，逐级稀释后将细胞接种在塑料平皿中。在培养箱内开放培养 14?d。然后取出培养皿，弃去培养液，PBS 清洗 2 遍，甲醇固定 15?min，去除固定液，姬姆萨染色 30?min，对含 50 个细胞以上的克隆进行计数，计算机进行统计学处理，用单击多靶数学模型进行曲线拟合做图，求曲线参数 D0、Dq 、N
6、 值。最后求放射增敏比(sensitization enhancement ratio, SER), 公式如下：SER=单纯照射组 D0 值比药物+照射组 D0 值。1.5 流式细胞分析1.5.1 实验分组 将增殖良好并处于对数生长期的 CNE2 细胞制成细胞悬液，随机分成 4 组：（1 ） 空白对照组：不加药物及不作照射，单纯培养液培养 24?h；（2） 药物治疗组：加入含100?mol/L 冬凌草甲素的培养液中培养 24?h；（3） 照射治疗组：照射 6?Gy，单纯培养液培养 24?h；（4 ） 联合治疗组：加入含100?mol/L 冬凌草甲素的培养液培养 24?h 后更换为单纯培养液；再
7、照射 6?Gy，单纯培养液培养 24?h。41.5.2 PI 分析细胞周期 收集不同组细胞，70%冷乙醇固定过夜，RnaseA 37?水浴消化 30?min，PI 避光染色 30?min，上流式细胞仪检测细胞周期分布。1.6 统计学处理 所有实验重复 4 次。所得数据经 SPSS 10.0 for windows 软件处理，结果用 s 表示，用 t 检验和方差分析。2 结 果2.1 冬凌草甲素对细胞放射敏感性的影响 单纯照射组细胞存活曲线的 D0=3.080.38，Dq=1.620.23 ；药物+照射组细胞存活曲线的 D0=2.510.31，Dq=1.320.19 。冬凌草甲素的 SER 为1
8、.227。2.2 不同处理对细胞周期的影响 正常状态下的 CNE2 细胞大多数处于 G1 期，S 期次之， G2/M 期最少。各治疗组细胞周期均发生变化：G1 期比例下降，G2/M 期比例上升，见表 1。其中以联合治疗组最明显，G1 期占(35.35.1)% ，G2/M 期占(45.26.5)%，与其余各组比较，差异有统计学意义（P0.05） 。*3 讨 论5鼻咽癌的临床治疗以放疗为主，化疗为辅，但大多数化疗药物的毒副作用较强，故寻找有效的天然抗肿瘤药物协同放射治疗以增强疗效、降低毒副作用，具有广阔的应用前景。冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来的有效抗癌成分，其主要化学结构是一种四环二萜类化合物。
9、有研究表明，冬凌草甲素具有广泛的抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞增殖具有显著的抑制作用，包括食管癌、肝癌、结肠癌以及白血病等35 。本研究中克隆形成实验结果显示，冬凌草甲素联合放射后较单纯放射后 D0 和 Dq 值减小。其中 D0 下降表示 CNE2 细胞对放射的敏感性上升；Dq 降低反映杀伤 CNE2 细胞的阈剂量变小。故加入一定浓度的冬凌草甲素，可使放射剂量减少，从而产生一定的放射增敏作用。本研究中流式细胞分析显示，与单纯药物治疗组和单纯照射治疗组比较，两者联合应用后 G2/M 期比例增加(P0.05)。虽然 G2/M期比例越高，越有利于肿瘤细胞 DNA 损伤的修复，使部分亚致死性细胞和潜在致死
10、性细胞恢复正常以避免凋亡，但是 G2/M 期较其他期对放射线敏感6 。总之，冬凌草甲素对 CNE2 细胞具有放射增敏性具有一致性，其放射增敏的机制可能与改变细胞周期有关。6【参考文献】 1 杨甫文，黄金中，林晓岚，等.姜黄素诱导鼻咽癌细胞凋亡机制的研究J.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2006，41(8):612616.2 肖大江，朱国臣，王晓岚，等. 田基黄、冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞系 CNE 细胞毒作用的研究J.齐齐哈尔医学院学报，2005，26(12):13961397. 3 冯长伟，潘祥林，邹俊晖，等. 冬凌草甲素对人白血病细胞系 K562 细胞生长的抑制作用J.山东中医药大学学报，2000，24 （ 3）：225226.4 张典瑞，任天池 .冬凌草甲素的药学研究进展J.中国药学杂志，2003，38 （ 11）：817820.5 刘明月，范魁生，樊青霞，等. 冬凌草甲素诱导结肠癌细胞凋亡的实验研究J.河南肿瘤学杂志，2004，17（3）：167168. 76 胡国清，孙银萍. 放射线对体外培养鼻咽癌细胞细胞周期阻滞、凋亡和抑癌基因 P57kip2 表达的影响J.华中科技大学学报（医学版） ，2005，34（6）：741743.
