《冬凌草甲素作用PI3K-AKT通路诱导HeLa细胞凋亡》由会员分享，可在线阅读，更多相关《冬凌草甲素作用PI3K-AKT通路诱导HeLa细胞凋亡（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1冬凌草甲素作用 PI3K/AKT 通路诱导 HeLa 细胞凋亡作者：沈宏伟， 胡红珍， 曾海涛， 柯佩琪， 杨越波， 李小毛， 任姿【摘要 】 【目的】研究冬凌草甲素诱导 HeLa 细胞凋亡的作用及其机制。 【方法】MTT 法测定冬凌草甲素对 HeLa 细胞的生长抑制实验, Hoechst 33342 荧光染色等观察细胞核形态学变化; LDH 法研究细胞死亡的途径。流式细胞仪检测细胞的凋亡，免疫印迹实验检测相关蛋白的表达。 【结果】 25 mol/L 以上的冬凌草甲素对宫颈癌 HeLa 细胞具有明显的生长抑制作用,并能诱导细胞发生凋亡,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞的生长抑制率及细
2、胞凋亡率均明显升高, 冬凌草甲素抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中, 细胞端粒酶 Akt、FKHRL、GSK3 表达水平及活性显著降低。【结论】 冬凌草甲素能够通过诱导人子宫颈癌 HeLa 细胞发生凋亡而发挥抑制 HeLa 细胞生长作用，抑制 Akt 和 GSK3 的活性是冬凌草甲素体外诱导人子宫颈癌 HeLa 细胞发生凋亡的重要作用机制之一。 【关键词】 宫颈癌； 冬凌草甲素； AKT/PKB2Abstract: 【Objective】 The purpose of our study was to investigate the apoptosis-inducing effect an
3、d mechanism of action of oridonin, a diterpenoid isolated from Rabdosia rubescens, in human cervical carcinoma HeLa cell line. 【Methods】Morphological analysis, nuclear condensation, and fragmentation of chromatin were monitored using Hoechst 33342 staining. Cell viability was assessed using the MTT
4、colorimetric assay. Cell apoptosis and apoptosis-related proteins in HeLa cell line were evaluated by flow cytometry and Western blot analysis. 【Results】Oridonin suppressed the proliferation of several cervical carcinoma HeLa cell line in a dose- and time-dependent manner. Oridonin treatment dephosp
5、horylated and/or inactivated constitutively active AKT, and glycogen synthase kinase 3 (GSK3). In addition, oridonin treatment of cervical carcinoma HeLa cell line down-regulated the expression of the inhibitor of apoptosis protein. 【Conclusion】 Our results showed oridonin may suppress constitutivel
6、y activated targets of phosphatidylinositol 3-kinase (AKT and GSK3) in cervical carcinoma HeLa cell line, inhibiting the proliferation and induction of caspase-dependent apoptosis.3Key words: cervical carcinoma; oridonin; AKT/PKB妇科恶性肿瘤之一4。研究表明它具有抑制 HeLa 或 HL260 细胞生长的作用5,6,但对其抑制 HeLa 生长的作用机制目前尚不明。信号转
7、导通路的异常改变是肿瘤细胞的重要生物学特性,其中磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol-3-kinases, PI3K) 在肿瘤信号转导中起着重要的调节作用。细胞在一系列内外因素的作用下,通过启动 PI3K/Akt 信号转导通路,诱导细胞的增殖、分化,避免细胞发生凋亡，在维持细胞恶性生物学特性中起重要作用。在肿瘤细胞逃避抗癌药物的杀伤过程中,PI3K/ Akt 信号转导通路可能起了极其重要的作用7,8。因此本研究将探讨冬凌草甲素是否通过作用 PI3K/ Akt 信号转导通路在抑制 HeLa 生长，为临床应用提供理论依据。1 材料与方法1. 1 细胞培养人宫颈癌 HeLa
8、 细胞株购自上海科学院细胞中心。HeLa 细胞由含有 100 mL/L 新生牛血清的 RP2MI 1640 培养液于 37 、体积分数 5%CO2 饱和湿度的细胞培养箱培养, 实验使用细胞均为接种后24 h 处于对数生长期细胞。41.2 诱导细胞凋亡的形态学观察及测量将细胞用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化,接种至 24 孔板中, 每孔含细胞数 4 104 个, 每孔 0. 5 mL 的完全培养液中,置 37 、体积分数为 5%的 CO2 培养 24 h ,更换新鲜培养基。加冬凌草甲素 ,使药物终浓度分别为 0、10、20 mg/L ,继续培养 48 h ,加 50 g/L 多聚甲醛(PBS,
9、pH 7.2) 4 mL ,固定 20 min。加入 Hoechst 33342 ,使终浓度为 5 mg/L,室温暗处静置 ,去上清液,加 PBS (pH 7.2)洗 2 次,在多功能倒置显微镜(Nikon TE300) 下观察, 并用 Leica DC200 拍照。1. 3 细胞生长率测定采用 MTT 法检测 HeLa 细胞的生长率。取对数生长期细胞,用完全培养液调整细胞数为 1104 个/ mL ,接种于 96 孔板,24 h 后分别加入终浓度为: 2.5, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0 mol/L 的冬凌草甲素作用 24 h,同时设置正常对照组(加实验组等体积培养液做对照
10、) ,每组 6 复孔，取药物作用 24 h 后,每孔加入 5 mg/ mL MTT 10 L ,摇床混匀后,继续培养 4 h ,每孔吸出 100 L 上清液, 同时每孔加入DMSO(国产 ) 100 L ,摇床混匀 15 min ,室温静置 20 min 后, 在酶标仪(波长= 495 nm/ 530 nm ) 测 A 值, 计算细胞生长率: 细胞生长率= （处理组/ 正常对照组） 100 %。并且采用上述方法检测 25.0 5mol/L 的冬凌草甲素作用 0，6，12，24 h 后 HeLa 细胞的细胞生长率。1. 4 流式细胞仪检测 HeLa 细胞凋亡率将 HeLa 细胞数按 1104/m
11、L 置于 100 mL 培养瓶中, 分对照组和药物组,药物组为 25.0 mol/L 的冬凌草甲素,分别作用0，6 ，12 ，18 ，24 h 后用于流式细胞仪检测，每组 6 复孔。细胞凋亡检测:收集对照组和药物组各 20 000 个细胞，PBS 液洗涤, 加入碘化丙啶( PI)工作液 0.5 mL (浓度为 10 g/mL) (北京岳泰生物公司) ,室温避光 30 min , FACScan 流式细胞仪分析和处理数据。1.5 Western blotting 检测 Akt、GSK3、FKHRL 的表达不同浓度的冬凌草甲素(10.0 mol/L, 25.0 mol/L, )处理 HeLa细胞
12、48 h 后,按常规方法裂解细胞, 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。用120 g/L 十二烷基硫酸钠 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PA GE) 分离蛋白, 电转移至 PVDF 膜。用含 50 mL/L 脱脂奶 Tris 缓冲液封闭膜上的非蛋白结合点, 4 过夜。分别加入 1 200 稀释的鼠抗人Anti-actin 抗体、Anti-phospho-Akt 抗体 (Santa Cruz Biotechnology, CA), Anti-phospho-GSK3 抗体（Cell Signaling Technologies，Beverly, MA)室温作用 4 h。漂洗 3 次后加第二抗6体(辣根过
13、氧化物酶标记的兔抗鼠 IgG 抗体 )室温作用 2 h,漂洗 3 次。加发光剂(Lumi GLO ),置感光盒中感光,显影,定影。实验重复 3 次。1.6 统计处理数据用 表示, 采用统计软件 SPSS 10.0 进行数据处理, 组间数据采用 t 检验或秩和检验。x2 结 果2. 1 冬凌草甲素诱导细胞凋亡的形态变化在相差显微镜下, 对照组细胞界限清晰,胞浆丰富,饱满; 在荧光显微镜下, 胞核圆形或椭圆形, 染色质均匀分布,少见强荧光的胞核( 处于染色体聚集的有丝分裂细胞核呈强蓝荧光) 。 HeLa 细胞被冬凌草甲素处理 24 h 后,凋亡细胞脱落悬浮于孔板底部; 冬凌草甲素终浓度 5.0 m
14、ol/L 时 ,细胞变圆,体积缩小 ,核呈强荧光的凋亡细胞明显多于对照组; 当终浓度 25.0 mol/L 时, 细胞变圆,体积缩小,表面粗糙,胞核缩小,呈强蓝色荧光,可见染色质浓缩呈斑块状, 出现凋亡小体,呈典型的凋亡细胞形态(图 1) 。2.2 冬凌草甲素抑制 HeLa 细胞生长7HeLa 细胞经不同浓度的冬凌草甲素处理 24 h 后, HeLa 细胞数明显减少, 5.0 mol/L 的冬凌草甲素时，细胞的生长率为(86.62.5)%, 25.0 mol/L 的冬凌草甲素时，细胞的生长率为(30.92.6)%。结果表明 HeLa 细胞经 25.0 mol/L 的冬凌草甲素处理 24 h 后
15、, 生长受到明显抑制, 见图 2A。25.0 mol/L 的冬凌草甲素作用 12 h 后 HeLa 细胞的生长受到明显抑制, 见图 2B。2.3 冬凌草甲素诱导 HeLa 细胞凋亡25.0 mol/L 的冬凌草甲素作用 HeLa 细胞 0，6，12，24 h 后, 细胞出现不同程度的亚 G1 峰(凋亡峰) , 作用 12 h 后诱导 HeLa 细胞凋亡明显增加，见图 3。2.4 冬凌草甲素对 Akt、FKHRL 、GSK3 表达的影响HeLa 细胞经过 25.0 mol/L 的冬凌草甲素作用 24 h 后, western blotting 分析表明， HeLa 细胞的 Akt、FKHRL 、
16、GSK3的表达均下调(P 0.01)。3 讨 论冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来的一种以贝壳杉烯( ent-8kaurene)为骨架的四环二萜类化合物,其化学结构为 C20 H26O7。大量资料证明9 , 冬凌草甲素对 EAC、HAC、S180、P388 及L1210 等多种移植性肿瘤均具有明显的抑制作用, 其对实体瘤的治疗目前已广泛的应用于临床,常用于食道癌、胃癌等多种实体瘤的治疗,并且均取得了明显的临床疗效。我们使用冬凌草甲素对宫颈癌 HeLa细胞的作用表明, 25 mol/L 以上的冬凌草甲素对宫颈癌 HeLa 细胞具有明显的生长抑制作用,并能诱导细胞发生凋亡,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞的生长抑制率及细胞凋亡率均明显升高, 冬凌草甲素抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中,细胞端粒酶Akt、FKHRL、GSK3 表达水平及活性显著降低,这在既往尚未见资料报道。宫颈癌的发病机制复杂，是多因素
