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1、 J J J 目 录1. 缩略词表1 2. 中文摘要2 3. 英文摘要5 4. 正文 9 (1)前言 9 (2)材料和方法 13 (3)结果 22 (4)讨论 29 (5)小结 33 (6)参考文献 34 5. 附录40 6. 致谢42 5综述44 J 英文缩略词表（abbreviations）英文缩写ATRAAMP英文全称All-trans retinoic acidampicillin中文名称全反式维甲酸氨苄青霉素单因素方差分析宫颈上皮内瘤变对氨基联苯胺ANOVACINOne-way analysis of varianceCervical Intraepithelial Neoplasi
2、adiaminobenzidimeDABDDP diamminedichloroplatinumDimethyl-sulphoxide顺铂DMSOEB二甲基亚砜Ethidium bromide 溴化乙锭HATs Histone acetyltransferasesHistone deacetylases组蛋白乙酰化转移酶组蛋白去乙酰化酶组蛋白去乙酰化酶抑制剂人乳头状瘤病毒免疫组织化学HDACsHDACiHPVHistone deacetylase inhibitorHuman papillomavirousimmunohistochemistryIHCSTAT3 Signal transduc
3、er and activator of 信号 转导和转录激活因子 3transcription 3PMSFPBSPhenylmethanesulfonyl fluoridephosphate buffered salintranscription factor lEsodium dodeyl sulphateThinprep Cytology TestValproic acid苯甲基磺酰氟磷酸盐缓冲液转录因子TFIIESDSTCTVPAWB十二烷基磺酸钠液基细胞学检查丙戊酸纳western blotting 蛋白免疫印迹1J VPA联合 ATRA抑制子宫颈癌细胞增殖的分子制研究中 文 摘 要研
4、究背景：子宫颈癌占女性恶性肿瘤的第二位，仅次于乳腺癌，该病的发病呈年轻化和上升化趋势。每年大约有 500,000名妇女被诊断为侵袭性子宫颈癌，80%来自于发展中国家，而且有一半患者死于此病。手术治疗目前已被认为是早期子宫颈癌的首选方法，但是对于后期、复发及远处转移的患者，手术治疗的效果是很差的。另外，此期的患者通常对化学药物治疗是耐药的，而且大多此期的患者本身的体质很差，也很难耐受化疗和放疗，所以大多数患者都死于无法控制。因此，寻找一种新的低副作用的治疗子宫颈癌的方法是必要的。组蛋白去乙酰化酶抑制剂( Histone deacetylase inhibitor，HDACi)对人类多种肿瘤具有潜
5、在的抗肿瘤治疗作用，因为其具有诱导肿瘤细胞分化、细胞周期阻滞及细胞凋亡作用。丙戊酸钠（Valproic acid ，VPA）作为一种抗精神病药物而被用来治疗癫痫和情绪失控，在此治疗浓度范围内作为 HDACi时仅产生轻微的副作用，甚至当血清浓度超过正常治疗范围时也是如此。据报道，在子宫颈癌中组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs）是过表达的，而且从子 宫颈细胞涂片中组蛋白 H3的磷酸化和乙酰化水平也表明，组蛋白 H3的修饰与子宫颈癌疾病进程从宫颈上皮内瘤样病变（Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN ）到 CIN再到CIN之间
6、有明显的相关性。因此 HDACs被认为是治疗子宫颈癌的一个靶点。全反式维甲酸（All-trans retinoic acid, ATRA）一种具有调节细胞生长和分化得药物，其同时具有调控正常上皮细胞分化。目前的临床实验已表明，ATRA 在子宫颈癌和癌前病变中具有化疗和诱导化疗的作用。ATRA 的作用通路是由 RA受体介2J 导的。在所有的 RA受体中，RAR (尤其 RAR2)被认为起主要的肿瘤抑制作用，而且它的缺失和肿瘤的进展有关。RAR 2的低表达在多种肿瘤中可见，包括肺癌、乳腺癌、头颈部癌和子宫颈癌。肿瘤细胞中此种受体的缺失和其基因启动子区组蛋白的超甲基化和去乙酰化有关。因此，HDAC
7、抑制剂联合 ATRA 可能会恢复沉默的 RAR2的表达，进而可在多种 肿瘤中发挥 ATRA的诱导细胞生长抑制及促凋亡作用。目的研究 VPA联合 ATRA对宫颈癌 HeLa 及 SiHa细胞株的生长抑制作用，并探讨其分子机制，为子宫颈癌的治疗提供理论依据和治疗线索。方法1.体外实验：采用 3mM VPA、1M ATRA、1g/mL顺铂(diammine dichloroplatinum DDP)单独和联合作用于子宫颈癌 HeLa及 SiHa细胞，对照组仅加溶媒；(1) 采用 MTT法检测药物 处理后子宫颈癌 HeLa及 SiHa细胞生长抑制率(2) 采用免疫 组织化学 SP 法检测药物处理后子宫
8、颈癌 HeLa 及 SiHa 细胞中 Ki67的表达差异。(3) 采用 Western-blot方法 检测药物处理后子宫颈癌 HeLa 及 SiHa细胞中 AC-H3、RAR2、p53、STAT3、p-STAT3、p21及 cyclinD1的表达差异。(4) 采用流式 细胞术（FCM）检测药物处理后子宫颈癌 HeLa及 SiHa细胞的周期。2.体内实验：将生长状态良好的 HeLa及 SiHa细胞接种到 CD1 nu/nu 裸鼠左侧肩胛部皮下，每只裸鼠接种细胞 5106个，待成瘤后，分别给与 VPA 采取腹腔注射终浓度为(300mg/kg/d)，ATRA( 15mg/kg/d)采取灌胃方法 DD
9、P 采取尾静脉注射终浓度为(2mg/kg)，每周 2次，对照组给予生理盐水。治疗时间为 4周。(1) 每 2天用游 标卡尺测量肿瘤大小，按照公式：肿瘤体积=（长宽 2）/2计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。3J (2) 28d后处死 动物，并将肿瘤组织剥离提取总蛋白，Western-blot方法检测 AC-H3、RAR2、p53及 p-STAT3及其下游基因的表达情况(3) 采用免疫 组织化学 SP法检测裸鼠瘤组织中 Ki67的表达变化结果：1.体外实验：(1) MTT 实验结果发现 VPA联合 ATRA对细胞有 显著的增殖抑制作用，差异有统计学意义（P0.05）。(2) Western-blo
10、t结果显示， VPA联合 ATRA显著提高裸鼠瘤组织中 AC-H3、RAR 2、p53及 p21表达，降低 STAT3、p-STAT3及 cyclinD1蛋白表达水平，差异有统计学意义（P 0.05).(2) Western-blot showed that the treatment lead to increase of AC-H3, RAR2, p53,p21while reduction in STAT3, p-STAT3 and cyclinD1 in tumor xenografts.(3) The expression of Ki67 in tumor xenografts af
11、ter treatment is lower than the controlgroup, (P0.05)ConclusionVPA alone or in combination with ATRA would inhibitor the growth of HeLa and cellsin vitro and inhibitor tumor xenografts effectively, which probably attributed to thehistone H3 hyperacetylation and up-regulation of RAR2, p53 and down-re
12、gulation ofp-STAT3 after treatment.Key words cervical cancer;valproic acid; all-trans retinoic acid; RAR2; HeLa cell;SiHa cells8 VPA联合 ATRA抑制子宫颈癌细胞增殖的分子机制研究1 前言 宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，是全球妇女中仅次于乳腺癌的第二个最常见的恶性肿瘤，在我国宫颈癌的发生占女性生殖道恶性肿瘤的第一位。现在我国每年仍然有新发病例 10万左右，且呈现年轻化趋势，随着医学技术的发展和普查工作的不断开展，早期发现和治疗，使得宫颈癌发病率显著下降，
13、但是长期生存率仍然低下。目前宫颈癌采用综合治疗模式，即手术、化疗和放疗。放疗对于年轻未育的患者卵巢损伤大，以顺铂为主的新辅助化疗毒副作用大1。因此，急需一种新的有效且低副作用的治疗方法来治疗子宫颈癌。随着分子生物学的发展，人们考虑在分子水平干预肿瘤生长以达到根治。目前，以免疫治疗和基因治疗为代表的生物治疗作为继手术、化疗、放疗之后的第四种治疗模式，日益受到重视。表观遗传修饰在肿瘤中起重要作用，对基因表达有重要影响的是染色质组蛋白乙酰化，依靠组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs
14、)的调控来平衡。染色质的乙酰化状态能导致肿瘤抑制基因或促凋亡基因低表达。组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (Histonedeacetylase inhibitors，HDACis)可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化，从而影响基因的表达，成为一类新的抗肿瘤药物。HDACis具有诱导细胞周期抑制和凋亡的抗肿瘤潜能。组蛋白乙酰化是一种可逆的蛋白共价修饰形式，组蛋白的乙酰化有利于 DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与 DNA 结合位点特异性结合，激活基因的转录。组蛋白低乙酰化状态时，核小体结构紧密，使各种促进细胞生长、分化和凋亡的基因转录受到抑制，和肿瘤的发生有关。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于9 动态平衡，并由 HAT 和 HDAC 共同调控。HAT 将乙酰辅酶 A 的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，HDAC 使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA 紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。 HDACi 能够促进组蛋白或非组蛋白的乙酰化修饰，从而调控细胞凋亡及分化相关蛋白的表达和稳定性，诱导细胞凋亡及分化
