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1、病毒感染与细胞凋亡,微生物教研组 郑方亮,细胞凋亡的含义,多细胞生物的一种生理性细胞死亡的过程；凋亡过程中，细胞的形态变化是特有的；凋亡过程中需要基因表达和蛋白质合成，特别是酶的合成。,概念：是由一系列基因控制并受复 杂信号调节的细胞自然死亡 的现象。,细胞凋亡和细胞程序性死亡,从严格的词学意义上来说，细胞程序性死亡与细胞凋亡是有很大区别的。 细胞程序性死亡的概念是个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。 细胞凋亡则是一个形态学的概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。一般认为凋亡和程序性死亡两个概
2、念可以交互使用，具有同等意义。,凋亡形态特征,Apoptosis “叶子凋落”,左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞,凋亡形态特征,分子生物学机制,细胞程序性死亡是细胞之间信号传导的结果之一。环境和发育的刺激通过配体和受体之间的相互作用传递到胞内，即配体携带的信号通过与穿膜细胞受体胞外区域的结合反应到受体的胞内区域，完成信号由胞外到胞质的传递，然后开始胞内一系列蛋白质与蛋白质之间的复杂作用，最后导致凋亡的发生。,凋亡的过程,信号传递阶段 死亡信号的探测胞外信号（配体与受体的特异结合）胞内信号（毒素、射线引起的损伤或病毒感染） 下游死亡机制的传递 效应阶段 Caspase的激活最终造成细胞死亡。,
3、凋亡信号转导系统特点, 多样性：不同种类的细胞系统不同 偶联性：与增殖分化的信号系统交叉偶联 同一性：多因素，共用同一系统触发 多途性：同一诱导因素启动多条信号转导 途径,凋亡的激活途径,Fas介导的细胞凋亡线粒体参与的细胞凋亡,Fas介导的细胞凋亡,富含半胱氨酸,死亡结构域,death effector domain,线粒体参与的细胞凋亡,BID,Caspase 可激活名叫CAD（caspase-activated Dnase）的核酸酶，CAD能在核小体的连接区将其切断，形成约为200bp整数倍的核酸片段。正常情况下CAD存在于胞质中，并且与抑制因子ICAD/DFF-45蛋白结合，不能进入细
4、胞核。Caspase活化后可以降解ICAD/DFF-45，释放出CAD，使它进入细胞核降解DNA。 Caspase可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，核纤层（Lamina）是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase在一个近中部的固定部位所裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。 Caspase可作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白，改变细胞结构。除此之外，Caspase还能灭活或下调与DNA修复有关的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白。,效应阶
5、段,吞噬,凋亡相关的基因和蛋白,细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。,Caspase家族,Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。它们均有以下特点：活性中心富含半胱氨酸；对底物天冬氨酸部位有特异水解作用，所以命名为caspase（ cysteine-containing aspartate-spicific protease ），方便起见本文称之为凋亡酶；都是由两大
6、、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。,分为两类：一类为执行者（executioner或effector），如caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一类为启动者（initiator），如caspase-8、9，收到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7,Apaf-1,Apaf-1被称为凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating fa
7、ctor-1），在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。Apaf-1含有3个不同的结构域：CARD（caspase recruitment domain）结构域，能召集caspase-9；ced-4 同源结构域，能结合ATP/dATP；C端结构域，含有色氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c结合到这一区域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素c和caspase-9参与。Apaf-1/细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就可以通过其CARD结构域召集caspase-9，形
8、成凋亡体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。,Bcl-2家族,Bcl-2为凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白。它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素c等凋亡因子的释放。Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4），并且通常有一个羧端跨膜结构域(transmembrane region ,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的结构域。根据功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类，一类是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一类
9、是促进凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3结构，如Bid、Bad。虽然Bcl-2蛋白存在于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，但主要定位于线粒体外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。,Fas,Fas又称作APO-1/CD95，属TNF受体家族。Fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的T和B淋巴细胞，巨噬细胞，肝、脾、肺、心、脑、肠、睾丸和卵巢细胞等。Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞走向凋亡。,p53,一种抑癌基因，其生物学功能是在G期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细
10、胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡，研究发现丧失p53功能的小鼠胸腺细胞对糖皮质激素诱导的调亡反应和正常细胞相同，而对辐射诱导的调亡不敏感。,C-myc,在许多人类恶性肿瘤细胞中都发现有c-myc的过度表达，它能促进细胞增殖、抑制分化。 在凋亡细胞中c-myc也是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。,ATM,ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene）是与DNA损伤检验有关的一个
11、重要基因。正常细胞经放射处理后，DNA损伤会激活修复机制，如DNA不能修复则诱导细胞凋亡。ATM是DNA损伤检验点的一个重要的蛋白激酶,细胞凋亡的检测方法,形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法彗星电泳法（comet assay）流式细胞分析,DNA电泳鉴定,+,坏死,凋亡,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker （ 自赵允、翟中和）,细胞凋亡的意义,确保正常发育生长：清除多余的细胞维持内环境稳定：清除受损、突变、 衰老的细胞积极防御功能：对病毒感染细胞阻止 复制,凋亡的重要性,正常情况下，凋亡在脊椎动物和无脊椎动物中扮演着重要的角色。凋亡使细胞死亡时仍保持细胞完整性，以此避免胞内物质的渗漏和由此引起的炎症反应。因此凋亡在正常组织细胞的更换、发育及免疫系统中起到了重要作用。,病毒感染与细胞凋亡的关系,病毒感染促进细胞凋亡病毒感染抑制细胞凋亡,流感病毒诱导的细胞凋亡,NS1,转录后调控子,
