《兔血管平滑肌细胞三维培养模型的建立》由会员分享，可在线阅读，更多相关《兔血管平滑肌细胞三维培养模型的建立（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1兔血管平滑肌细胞三维培养模型的建立作者：潘勇艾玉峰张琳西熊猛 【关键词】血管平滑肌细胞 关键词: 血管平滑肌细胞;三维培养; 细胞培养 /方法 摘要: 目的观察兔血管平滑肌细胞（VSMCS）在三维培养系统中的生物学特性.方法在兔主动脉中膜来源的 VSM-CS 单层培养系统的基础上，将 VSMCS 培养在胶原凝胶中，形成 VSMCS 三维培养系统.并对细胞的形态结构、生长增殖及其影响因素进行研究.结果三维培养 VSMCS 在凝胶形成后 34h，形成多个细胞突起，呈星状. 后继续伸展，呈梭形、纺锤形. 张力条件下，三维培养VSMCS 可呈一定的方向性排列. 三维培养 VSMC S 与经典的单层培
2、养相比，细胞活力无统计学差异. 但细胞增殖受到一定程度的抑制.结论运用 VSMCS 三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态结构、生长增殖等方面，还可研究在张力条件下的细胞生物学特征，对组织工程化血管的研究将产生积极的影响. Keywords:vascularsmoothmusclecell;three-dimensionalculture;cellculture/methods Abstract:AIMTostudythebiologiccharacteristicsofrab-2bitvascularsmoothmusclecell（VSMCS） culturedin“three-dime
3、nsional”cellculturesystem.METHODSBasedonthemonolayercellculturesystem，weresuspendedVSMCSde-rivedfromthemediaofarterialwallinasolutionofpolymer-izingcollagentodevelopa“three-dimensional”cellculturesystem.Inthissystem，westudiedthemorphology，growth，proliferationandmetabolismofVSMCS，andtheshapeandarrang
4、ementofVSMCinfluencedbyretractionofthesubstrate.RESULTSAfterVSMCSwereculturedin“three-dimensional”cellculturesystemfor34hours ，theyformedmanycellprominences.Withcellsextending，theshapeofthecellschangedfromstartoshuttleorspindle.Undertheconditionoftension，VSMCSculturedin“three-dimensional”cellculture
5、systemtookondirectionallyspecificarrange-ment.Incontrasttothemonolayercellculturesystem，thelivingnessofVSMCSculturedin“three-dimensional”cellcul-turesystemhadnostatisticaldifference，butcollagenre-strainedcellproliferation.CONCLUSIONVSMCS“three-di-mensional”culturesystemwillhaveapositiveeffectonthest
6、udyo3ftissue-engineeringvessel. 0 引言 血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells，VSMCS）位于动脉壁中膜，它对管壁的完整性和调节血管的紧张性起着重要作用. 在经典的单层培养系统中，VSMCS 离开了在体内与细胞外基质共同构成的三维立体生长环境，因而所表现出的生物学特性与在体状态存在较大的差异.我们在 VSMCS 单层培养的基础上，将兔主动脉 VSMCS 置于胶原凝胶中，使其在体外与细胞外基质形成一个整体，观察其在三维状态下的生物学特征，为构造结构和功能与在体血管中膜相似的中膜组织，最终形成组织工程化血管提供实验依据. 1 材料和方
7、法 1.1VSMCS 培养 VSMCS 来自新西兰大耳白雄性家兔，体质量 2.02.5kg（由本校实验动物中心提供） .3040mgkg-1 戊巴比妥钠静脉麻醉后，在无菌条件下，迅速将主动脉自胸腔取出，放入盛有 D-Hanks 液的平皿中.清洗凝血块，剥除外膜，将血管翻转使内膜面朝外，用刀片自上而下刮12 遍，去除血管内皮细胞.然后用显微镊撕下血管中膜的平滑肌层，4用显微剪将其剪碎（0.5 1mm3 ） ，接种于培养瓶中，在950mLL-1 空气，50mLL-1 二氧化碳，37 ，饱和湿度条件下放置 2.53h，使组织块较牢固地粘附于瓶壁，加入含 200mLL-1 新生牛血清（Hyclone
8、公司）的DMEM（Dulbeccosmodifiedminimalessentialmedium，Gibco 公司）培养液，34d 更换含 100mLL-1 新生牛血清的 DMEM 培养液1 次. 细胞生长形成致密单层时，细胞呈典型的峰-谷样表现（Fig1）.此时可用 1.25gL-1 胰蛋白酶（Sigma 公司）消化，按12 比例分种传代培养，56d 可继续分种传代 1 次.VSMCS 行-激动蛋白抗体（中山公司）SABC 法免疫组化染色鉴定（Fig2）.实验采用第 24 代细胞进行研究. 1.2 胶原制备 1实验所用胶原溶液为可溶性鼠尾腱胶原，其主要成分为 I 型胶原 .将体质量 2002
9、50g 的 SD 大鼠尾部剪下，浸入 70mLL-1 乙醇溶液中，20min 后在无菌条件下抽出尾腱并将其剪碎，置入 0.5mLL-1 的醋酸溶液中（约150mL/尾） ，在 4条件下不时搅拌.48h 后离心（10000rmin-1，11000g ，LG10-2.4A，北京医用离心机厂）约 1.5h，去渣.上清液用 100gL-1NaCl 溶液盐析，最后将沉淀的蛋白质溶于 41mmolL-1 的 HCl 溶液中备用.Lowry 法测定蛋白浓度为 4gL-1. 51.3VSMCS 三维培养系统的建立 2将第 24 代指数生长期 VSMCS 用 1.25gL-1 胰蛋白酶消化，调整细胞悬液浓度为
10、5109 个L-1.按细胞悬液 2V新生牛血清1V5DMEM 液 2V胶原溶液 5V 的比例，4条件下将四种成分快速混匀，加入数滴 1molL-1NaOH 调 pH 值至中性（培养液中酚红指示） ，形成 VSMCS-胶原混悬液，并立即将该混悬液移入 6 孔培养板（Nunc 公司）内，0.5mL/孔，置 37 培养箱内10min，混悬液即形成凝胶状，即 VSMCS 三维培养系统. 每孔加入2mL 含 100mLL-1 新生牛血清的 DMEM 液，3d 换液 1次. 1.4 观察指标 细胞形态学观察: 在含 VSMCS 凝胶块形成后4，12 ，24，48，72h 和 1wk 时，在倒置显微镜下观察
11、凝胶块中VSMCS 形态学的改变. 将培养 24h 的凝胶块经 30mLL-1戊二醛原位固定、脱水、干燥、喷金行 S-2700 型扫描电镜（HITACHI 公司，西安交通大学电镜室）观察.张力条件下的细胞形态学改变:在上述的 VSMC S 三维培养 24h 后，用无菌注射器针尖轻轻将凝胶块与培养皿的周边部分分离，使胶原收缩并漂浮在培养液中，保持凝胶块的中心部分在整个培养过程中都贴附在培养皿的底部.在倒置显微镜下观察张力条件下凝胶块中 VSMC 6S 形态学变化 .活细胞染色及细胞计数:将用 MTT（四甲基偶氮唑，Gibco 公司）配成的染液适量滴入培养液中，4h 后，MTT 被细胞线粒体上的琥
12、珀酸脱氢酶还原成难溶性的蓝紫色结晶物，沉积在细胞内或细胞周围，使活细胞显蓝黑色，而死亡细胞则不着色.在倒置显微镜下逐个计数细胞，并以活细胞的百分率表示细胞活力（即每视野 100 个细胞的活细胞数）.胶原凝块用细菌胶原酶（4gL-1， Sigma 公司）消化成细胞悬液，用血球计数板在镜下行细胞计数.统计学分析: 所得资料应用 t 检验进行比较分析. 2 结果 2.1 三维培养的 VSMCS 形态含 VSMCS 的胶原网形成时呈透明状态，凝胶化后变得不透明，并形成可被握持的凝胶块，粘附在培养皿的底部及四壁上.在倒置相差显微镜下，可清楚地看到各个层次的细胞及其形态.VSMCS 在凝胶中的位置固定，并
13、分布于不同的层次，说明此时 VSMCS 已经粘附在胶原支架上.约 34h，呈圆形的 VSMCS 表面逐渐伸展延长，形成多个胞质突起，呈星状（Fig3） ，表明 VSMCS 已开始与胶原纤维发生粘着.扫描电镜下可见 VSMCS 的胞质突起粘附在呈无续网状分布的胶原丝上（Fig4）.随时间推移，胞质突起继续伸展，部分细胞呈现梭形、纺锤形（Fig5）.2.2 张力作用下的细胞形态学改变在凝胶与培养皿壁分离前，细胞生长无一定的方向性.当凝胶与培养皿壁分离时，凝胶块发7生收缩，方向朝向中心部，在分离的瞬间，VSMCS 的胞质突起消失. 随着时间的延长，细胞又逐渐出现胞质突起，但周边漂浮的凝胶块中的 VS
14、MCS 与贴附于器皿底的凝胶块中心中的细胞出现了不同的形态:周边部细胞以梭形、纺锤形，呈同心圆环状生长（Fig6）;中心部细胞生长与分离前无大的差异.伴随凝胶块的收缩，两部位的平滑肌细胞均变得愈加致密.有时互相交织呈网络. 2.3 细胞的活力与增殖 VSMCS 在胶原形成的基质中培养10d 后，观察细胞的形态学改变和细胞计数结果表明:胶原凝胶中细胞数无增加.说明在三维培养系统中，VSMCS 并未出现增殖现象.同时 MTT 染色结果表明:三维培养的 VSMCS 能够保持足够的活力（865，n=10）.与 10d 前接种当日（903，n=10）相比较，细胞活力无显著性差异. 3 讨论 VSMCS
15、的体外培养始于 20 世纪 70 年代3. 它将血管中膜的 VSMCS 从体内复杂的影响因素中分离，并置于一定控制因素的直接作用下，连续、直接地观察和研究活细胞的形态结构、细胞活动、生长增殖、物质代谢及其影响因素.然而，单层培养系统中的细胞呈二维方式生长，VSMCS 脱离了在活体状态下与细胞外基质共同构成的连续整体.近年来，大量研究表明，细胞外基质不仅在维8持组织结构方面发挥重要作用，而且具有重要的生物学特性.细胞与细胞外基质相互依存，相互作用，才能维持细胞的正常形态，进行正常的代谢，增殖、分化、迁移及信号传递4.因此，将 VSMCS培养在胶原这种细胞外基质成分中，使之构成一个整体，在模拟活体
16、血管组织的环境中表达各种生物学特性，使体外研究结果能更加真实地反映体内情况，结果也必定具有更为重要的参考价值. 图 1图 6 略 胶原是细胞外基质最基本的结构，它以支架形式为细胞和其他细胞外基质成分提供结合部位.鼠尾腱胶原在结构和抗原性方面与人体组织的 I 型胶原基本相同，它的来源广泛，成分较为单一，制备较方便，VSMCS 在该基质中能长时间地保持活力，故被选用作为培养基质. VSMCS 的形态学变化充分反应了细胞与胶原纤维相互作用的过程.在早期，由于纤维排列的多向性，VSMC S 的胞质沿纤维运动并产生多向性突起，使细胞呈星状. 随着两者的相互作用，纤维发生改构，其排列逐渐由多向性转变为单向性，VSMCS 的胞质突起也随之表现为双极性，细胞呈梭形，较单层培养系统中的细胞更具立体感.同时，在三维系统中，尽管存在血清的刺激作用，但因 VSMCS 受到胶原基质的抑制作用，所以生长增殖9为相对静息状态. 含
