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1、1兔纤维环细胞和骨髓间充质干细胞共培养的初步研究作者：张福勇，吴小涛，王运涛，鲍军平，朱磊，邱匀峰【摘要 】 目的：初步探讨骨髓间充质干细胞（BMMSCs）与纤维环（AF ）细胞的共培养对细胞增殖及主要细胞外基质的影响，进一步确定 BMMSCs 移植对椎间盘退变的预防和治疗作用。方法：分别培养兔的 BMMSCs 与 AF 细胞，将两种细胞按 11 的比例混匀，利用离心管培养技术培养 3 周后取材，大体观察并行 HE 染色；使用荧光染料 Hoechst33258 检测细胞增殖；通过实时荧光 PCR对型胶原、蛋白多糖含量进行测定。结果：在体外培养 3 周后，细胞团体积达到最大，涂片染色显示共培养组
2、细胞致密，细胞增殖较对照组明显，实时荧光 PCR 检测结果显示型胶原及蛋白多糖mRNA 表达增强。结论：在离心管内三维培养条件下，BMMSCs与 AF 细胞共培养能够促进增殖，增加型胶原和蛋白多糖的含量。【关键词】 骨髓间充质干细胞； 纤维环细胞； 生物医学工程； 细胞培养； 兔下腰痛是一种常见的骨科疾患，发病率高，75%80 的人在2其一生中的某个阶段都会受到下腰痛的困扰。椎间盘退变是导致下腰痛最常见的原因，临床常用的手术及保守治疗虽然能够取得一定的治疗效果，但并非针对椎间盘退变本身，目前的治疗方法并不能够阻止椎间盘的退变1 。椎间盘退变的合理解决方法就是对退变的椎间盘进行生物学修复。椎间盘
3、有外层的纤维环（AF） 、内部的髓核及上下终板构成。在椎间盘退变防治研究中,AF 的生物学作用越来越受到人们的重视,维持和修复 AF 的完整性有着重要的意义2 。本研究观察骨髓间充质干细胞（BMMSCs ）与 AF 细胞共培养后是否可以促进细胞增殖及蛋白多糖和型胶原的表达，达到阻止和抑制椎间盘退变的目的。1 材料与方法1.1 实验仪器与材料实验仪器包括 721 分光光度计(上海市仪器厂)，高速冷冻离心机(德国 Heraeus 公司)，倒置荧光相差显微镜(德国 Zeiss 公司)，5%CO2 细胞培养箱( 德国 Heraeus 公司)，数码照相机 (日本 Canon公司)；实验材料有木瓜蛋白酶(
4、E.Merck 公司)，100%胎牛血清( 杭州四季青生物公司)，胰蛋白酶( 美国 Sigma 公司)，台盼蓝试剂(美国 Sigma 公司 )，塑料离心管(Corning 公司)，LG-DMEM 培养基、型胶原酶、Hoechst33258 和 Calf Thymus DNA 等试剂3（Gibco 公司）;新西兰大白兔由江苏省农业科学院提供。实时荧光PCR 委托上海拓科生物技术有限公司检测。1.2 实验步骤1.2.1 取材1.2.1.1 BMMSCs 的分离 取 1 月龄新西兰大白兔 30 只,雌雄不拘, 体重 0.50.6 kg，1%戊巴比妥钠按 2 mlkg-1 的剂量施以全身麻醉，无菌操作
5、下切取兔的股骨,两端剪断,用 PBS 液冲洗,收集细胞,离心后用 15的胎牛血清 DMEM 培养液制备成细胞悬液,然后于37 、5 CO2、100 饱和湿度条件下培养。5 d 后第 1 次换液，以后每隔 3 d 换液 1 次，培养至第 3 代3 。1.2.1.2 AF 细胞的分离 取 1 月龄新西兰大白兔 54 只，雌雄不拘，体重 0.50.6 kg，同上法麻醉后无菌条件下取出兔的脊柱，剔除周围软组织，取出椎间盘，放入含有 PBS 的培养皿内，用眼科剪去除终板及髓核组织，将 AF 的最外层及最内层去除，留取中间部分（图 1） ，用 PBS 液冲洗 3 遍后，用眼科剪将组织剪成 1 mm3 大小
6、，移入含有 20 ml型胶原酶的培养皿内消化 68 h，120 目过滤器过滤后 PBS 液洗涤 3 遍，用 15的胎牛血清 DMEM 培养液制备成细胞悬液,置 37 、5 CO2 、100 饱和湿度条件下培养。5 d 后4第 1 次换液，以后每隔 3 d 换液 1 次，培养 3 周后待用4 。图 1 终板及髓核被清除后的 AFFig 1 AF after nucleus pulposus and endplate were removed1.2.1.3 共培养模型的建立及分组 单层培养的细胞经胰酶消化后，按照每管含 5105 BMMSCs、AF 细胞或 11 的比例混合细胞，将细胞悬液移入 1
7、5 ml 塑料离心管内，再加入 DMEM 培养液至 5 ml，其中含 10的胎牛血清、100 Uml-1 青霉素、100 gml-1链霉素，pH 7.4，以 20g 的离心力低速离心 5 min 形成微球，置于 37 、5CO2、100 饱和湿度下培养，由此形成 3 个观察组，即 BMMSCs 组、AF 细胞组和共培养组。5 d 后第 1 次换液，以后每隔 3 d 进行半量换液，培养至第 21 天对各项指标进行检测4 。1.2.2 观察指标1.2.2.1 组织学检查 取离心管内培养的细胞团，大体观察并涂片、固定，然后行 HE 染色，观察细胞形态和组织结构。51.2.2.2 DNA 含量测定 培
8、养 3 周后，组织块用 20 Uml-1 的木瓜蛋白酶消化过夜，采用 Hoechst33258 荧光法测定各离心管内细胞的 DNA 含量。20 l 标本中加 1 gml-1 的 Hoechst33258 溶液 2 ml，以牛胸腺 DNA 作为标准品绘制标准曲线，比较测定结果。1.2.2.3 型胶原及蛋白多糖的 PCR 检测 细胞培养 3 周后, 以Trizol 试剂裂解细胞。实时荧光 PCR 法检测 mRNA 表达：应用Cyber Green 法，实时荧光 PCR 在 MJ OPTICON 2 定量 PCR 检测仪上进行，实验结果用 OPTICON Monitor Analysis 软件分析。
9、所用引物序列均由上海生工生物工程公司合成。型胶原蛋白正义链 GACCCCATGCAGTACATG,反义链 GACGGTCTTGCCCCACTT；蛋白聚糖正义链GAGGTCGTGAAAGGTGT,反义链GTGTGGATGGGGTACCTGAC。1.3 统计学处理结果采用 SAS 8.1 统计学软件分析，数据以 x-s 表示。多组间比较用单因素方差分析，两两比较用 t 检验，P0.05 为差异有统计学意义。62 结 果2.1 光镜及大体观察AF 细胞贴壁速度相当缓慢,5 d 后开始有部分细胞贴壁， 15 d 后细胞贴壁数目不再增多，初始细胞呈圆形，后呈多角形、梭形或不规则形状,轮廓清楚 ,细胞核呈
10、圆形，见图 2。 细胞悬液经离心后，在离心管底部形成小的细胞团，直径约 1 mm。3 d 后细胞团的体积逐渐增大，BMMSCs 组细胞团松散易碎，共培养组细胞团紧密不易吹散，AF 细胞组居中。至第 3 周时，细胞团体积达到最大，共培养组细胞团可达到 6 mm，BMMSCs 组细胞团未见明显增大，AF细胞组细胞团体积略小于共培养组。2.2 细胞形态学观察至第 3 周时，HE 染色观察细胞形态，AF 细胞呈圆形或不规则形状，排列欠规整；BMMSCs 呈椭圆形，排列稀疏欠规整；共培养组细胞呈圆形或不规则形状，细胞排列紧密，见图 3。2.3 DNA 含量测定在细胞接种后第 1 周，细胞 DNA 含量变
11、化不明显；第 2 周时7DNA 含量共培养组迅速增加，AF 细胞组稍增加， BMMSCs 组减少；第 3 周时趋于稳定。共培养组 DNA 含量随时间延长而逐步增加，至第 21 天时明显高于 BMMSCs 及 AF 细胞组，差异有统计学意义（均 P0.05,表 1） 。 表 1 培养不同时间细胞 DNA 含量测定结果2.4 型胶原及蛋白多糖 mRNA 的表达体外培养 3 周的细胞经实时荧光 PCR 检测显示，共培养组细胞的型胶原及蛋白多糖基因表达明显高于 AF 细胞组及 BMMSCs 组（均 P0.01，表 2） ，且 AF 细胞组的表达量明显高于 BMMSCs组（均 P0.05） 。表 2 型
12、胶原及蛋白多糖的 mRNA 表达(3 讨 论椎间盘随着年龄的增加以及各种因素的影响而逐渐发生退行性变化。椎间盘退变的病理改变之一为 AF 的应力损伤,导致 AF 微断裂,使髓核突出。在椎间盘退变的早期，具有修复能力的 AF 细胞上调蛋白多糖和其它间质中的大分子，内部 AF 蛋白多糖含量的增加可在一定程度上弥补成人早期髓核蛋白多糖的下降5 。退变晚期的椎间盘内细胞数量减少及功能受损，使得 AF 的自身修复能力下降，难以维持和修复自身的退变。此外椎间盘内细胞密度低，来源受限，使得通过简单的椎间盘细胞移植来修复 AF 存在困难。目前主要根据椎间盘退变的程度来决定修复策略，在退变晚期，椎间盘细胞代8谢
13、功能严重受损，已经不能够回应任何的生物学刺激，必须借助生物工程学以达到修复的目的。三维培养能够稳定椎间盘细胞的形状和结构，是维持细胞形态和表型所必需的。离心管培养是一种新而简单的培养椎间盘细胞的技术。这种三维培养只需要简单的离心，细胞团内相邻细胞间形成三维接触，有利于细胞外基质的合成6 。分泌的细胞外基质使得细胞紧密地结合在一起，形成细胞与细胞间的接触，模拟椎间盘内的环境，有利于细胞团内的细胞维持天然的表型。细胞团在最初的 2 周内显著长大，3 周后趋于稳定，达到最大尺寸。细胞团体积的增大是由于细胞外基质的合成及细胞的增殖，之后体积不再增大与通往细胞团中心的营养通道下降有关。BMMSCs 具有
14、以下特点：取材方便且对机体无害；由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题；它可以向多种组织类型分化，在体外可大量培养扩增；转入外源性基因后不影响其特性3 。因此， BMMSCs 成为骨组织工程理想的种子细胞，在治疗椎间盘退化方面取得了实质性的进展。本研究我们测试BMMSCs 是否能够调整 AF 细胞蛋白多糖和 型胶原的合成，是否可用于治疗或延缓椎间盘退变。髓核细胞在椎间盘退变过程中逐渐消失，因此在体内 BMMSCs 主要作用于 AF 细胞，而且获得大量有活性的髓核细胞相当困难，从而 AF 细胞成为修复椎间盘退变的靶向细胞4 。椎间盘细胞与 BMMSCs 间及其细胞与细胞外基
15、质间的相互作用机制尚不清楚，可能与细胞间缝隙连接及细胞因子等9因素有关。Gruber 等7证实了 AF 细胞间存在着缝隙连接，它的存在可以促进细胞的增殖及细胞外基质的分泌。Yamamoto 等8证实了共培养模型中 TGF-1、IGF- 1、EGF、PDGF 等含量明显增高，这些生长因子主要来自于 BMMSCs，它们被证明可以促进椎间盘细胞的生长。本研究中的离心管培养模型有利于 BMMSCs 与 AF 细胞间细胞因子的传递，有利于缝隙连接的形成，有利于细胞的增殖及细胞外基质的分泌，证明了体外共培养此两种细胞存在着可能性，且细胞团内的细胞维持着分泌细胞外蛋白多糖和型胶原的能力。本研究为进一步探索
16、BMMSCs 治疗椎间盘退变的可能性提供了证据。【参考文献】 1HOWARD S A,EUGENE J T,MASUDA K.Biological repair of intervertebral discJ.Spine,2003,28(15):S86- S92.2PETER J R.Biology of intervertebral disc aging and degeneration involvement of the extracellular matrixJ .Spine,2004,29:2691- 2699.3赵梓汝, 吴小涛 ,祁亚斌,等. TGF-1 干预下体内兔骨髓间充质干细胞对退变椎间盘治疗的实验研究J.中国矫形外科杂志,102006,14(13):1019- 1022.4VISAGE
