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1、1免疫组化技术的标准化质控管理【关键词】免疫组织化学；病理学,临床；质控管理 免疫细胞学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，它是在免疫学理论基础上利用抗原与抗体的特异性反应，在细胞或组织中定位抗原或抗体。免疫组化技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。随着免疫组织化学技术在临床病理研究与诊断中的广泛应用，因其反应步骤多，影响因素复杂，质量控制已被越来越多的病理技术专家重视。2008 年全国病理学技术进展和应用研讨会上提出将质控应用到免疫组化技术上。本文对免疫组化技术的标准化质控管理进行了探索，现介绍如下。 1 标本的固定 为了更好地保持细胞和组
2、织原有的形态结构，防止组织自溶，必须对标本进行固定。标本固定的好坏是影响病理诊断的关键，同样也影响免疫组化的结果，所以固定是质控的首要也是关键步骤。影响标本固定主要因素有以下几点。标本离体后固定不及时：一般离体标本要求 15min 内必须固定1，最好是在手术室由专业的护士将离体的标本用清水冲洗干净后立即放入质量浓度 40g/L 中性甲醛内，固定液的用量为标本体积的 510 倍。而目前本院手术室做不到这一点，这就要求病理技术员在接到标本后要及时固定，不2能延误时间。但是在手术室和路上延误的时间不能控制。因此，呼吁临床医生应和病理科联合起来，将标本固定地点放在手术室，以使标本及时固定，减少因固定不
3、及时而出现的诊断困难。标本固定的时间：40g/L 中性甲醛渗透速度一般是 2mm/h，随着时间延长速度会逐渐减慢，增加浓度反而会降低渗透速度。一般手术标本用 40g/L 中性甲醛固定的时间以 1224h 为佳，最长不要超过72h；如穿刺标本可用 AFF 液固定 24h。有研究显示，用 40g/L中性甲醛固定 1 周后的标本，其组织抗原几乎不能被检出1。但是，日常工作中常常会遇到有人催发病理报告的情况，他们希望病理科的报告最好像检验科那样早晨送下午就能拿到。这种情况下只有缩短制片程序，包括固定时间，这种操作只会增加病理诊断的风险，埋下误诊的隐患。固定液的种类及浓度不恰当：免疫组化检测常用的固定液
4、有 40g/L 中性甲醛、40g/L 钙 甲醛、40g/L 多聚甲醛磷酸缓冲液等。穿刺标本可用 AFF 液固定。固定液浓度过高、过低都会因组织固定差而导致组织抗原丢失或易出现非特异性背景染色，从而影响免疫组化结果。EDTA 是用于骨组织脱钙的螯合剂，因在脱钙过程中对组织的破坏性小而得到广泛使用，缺点是脱钙时间太长。标本固定时处理不当：如淋巴结组织往往因包膜没切开，影响了固定液的渗透，而使组织固定差。大标本因没切开固定，而使标本固定不匀等，都可影响免疫组化染色。我们接诊了很多低级别医院来会诊标本，都存在以上问题，因固定差而直接影响免疫组化结果及诊断。 32 切片与烤片 免疫组化检测的切片厚以 3
5、4m 为宜，淋巴结组织可行2m 厚切片，太厚影响染色结果和诊断。因免疫组化反应步骤多，易出现脱片现象，需要将载玻片处理后方可使用。处理方法：先将载玻片用肥皂水洗净后，放入清洁液中浸泡 1224h ，清水冲洗2h，蒸馏水洗 5 遍，体积分数 0.95 乙醇浸泡后，用干净的绸布擦干，再挂胶。挂胶方法有很多种，如：APES、铬矾明胶液、多聚赖氨酸等。切片裱片要完整，不能有气泡，烤片时温度不能过高，65烤 30min 即可进行染色。烤片时间过短易造成脱片，温度过高或过长可破坏抗原。 3 减少或消除非特异性染色 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色。最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶原
6、和结缔组织成分上。常见的消除方法有：在滴加第一抗体前用体积分数 0.020.05 山羊血清或牛血清封闭组织上带电荷基团，而除去与第一抗体的非特异性结合。此种方法一般用于不需抗原修复的抗体或内源性生物素较高的组织效果佳。体积分数 0.030.06 过氧化氢法是目前最常用的方法之一，我们认为体积分数 0.05 过氧化氢处理 1015min的效果较好。洗涤过程中用高盐缓冲液冲洗切片，也是消除非特异性染色的方法之一。方法是将磷酸缓冲液中加入 10g/L 的氯化钠4（pH7.4） 。稀释抗体浓度，但必须通过阳性对照来掌握稀释的最佳浓度。我们的实践证明，应用北京中杉试剂公司生产的 PV9000二步法试剂盒
7、，可有效地避免内源性生物素造成的非特异性染色，且操作简便。4 抗原修复 免疫组化在病理学上的应用常因甲醛固定等因素影响造成抗原失活。解决因固定包埋导致抗原失活的问题有 3 个途径：开发新型抗体以识别甲醛固定后的组织抗原或提高免疫组化试剂的灵敏度；用改良固定液取代甲醛；挽救因甲醛固定而失活的抗原，即抗原修复。而后者因方法简单而增敏效果显著，在病理技术中得到广泛应用。抗原修复是影响染色结果的最关键因素，目前最常用的是加热煮沸法，少数用酶消化法。加热抗原修复是 1991 年由SHI 等最先报道，其机制是通过加热打开了组织抗原因甲醛固定所引起的抗原表位的交联。修复的方法有高压法、微波法、水浴法等。英联
8、邦免疫细胞化学室间质控组织（UKNEQASICC ）进行的有105 家实验室参与、历时两年的研究结果显示，ER、PR 染色偏弱是由于微波加热时间不足与实验中操作控制不当所致，强烈推荐使用高压抗原修复2。国内也有专家研究表明，目前抗原修复最突出和最顽固的问题是修复不够。各种修复方法染色强度比较，高压法水浴法微波法。抗原修复液常用的有枸橼酸缓冲液（pH6.0） 、EDTA 缓冲液（pH8.09.0）等。在 2008 年全国病理学技术进展和应用研讨会上周小鸽教授做了以下实验（图 1）：A5类抗原在任何 pH 条件下，修复效果都很好；B 类抗原在低和高 pH时，修复效果好，但在中等 pH 时，修复效果
9、很差； C 类抗原随着pH 的增高，修复结果越来越好。如果实验室只想用 1 种修复液，又能兼顾 3 类抗原，就可选择图中 3 条曲线最靠近的区域所对应的pH 值，此处所对应的 pH 为 8.09.0。因此，他认为高 pH 修复液比低 pH 修复液更好。我们认为高压修复具有压力稳定、受热均匀、阳性检出率和阳性强度高、背景着色少等优点，对核染色阳性的抗原用 pH9.0 的 EDTA 修复液效果较好，胞浆胞膜染色阳性的用 pH8.0的 EDTA 抗原修复液修复的效果较好，但如果采用 pH9.0 的 EDTA在高压修复时易脱片。高压修复的方法是：先将高压锅内的修复液煮沸，将切片放入高压锅内，将压力加热
10、至最大（105kPa）12min, 加热功率不要大于 1000W。有研究表明，Ki67 与 P53 在使用电磁炉加热时，随着功率的增强，阳性强度反而减弱。我们认为只要功率在 800W 左右，不管是电磁炉还是电炉加热对免疫组化的结果影响都不大。 5 标准化实验对照 免疫组化对照实验的设立在免疫组化标准化中是极其必要的。随着病人法律意识的不断增强，医患之间的矛盾越来越大，病理医师的诊断风险也越来越大。这就要求医生对染色结果要有正确判断，同时也对病理技术人员提出了设立阳性和阴性对照的要求，这不但是对病人负责，也是保护自己的一种方式。阴性对照是用确定不含6有待测抗原的组织作为阴性对照组织，阳性对照是对
11、照组织中含有已知的抗原3。我们认为在日常工作中设置阳性对照最关键，通常是用阑尾来做阳性对照组织，因为阑尾中含有多种组织成分如上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。 图 13 种抗原不同 pH 条件下修复效果（略） 总之，要做出好的免疫组化结果，除了要求病理技术人员掌握丰富的理论知识外，还要求有较强的责任心，严格按标准化、规范化操作，只有这样才能更好地将免疫组化技术应用于临床，服务于病人。 【参考文献】 1王小亚,崔全才 .免疫组织化学病理诊断M.北京：北京科学技术出版社,2007： 47. 2王伯沄.免疫组织化学病理诊断 M.北京：北京科学技术出版社,2007：1920. 3王伯沄,李玉松 .病理学技术M.北京：人民卫生出版社,2001：365.
