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1、1光气染毒对小鼠肝脏的损伤作用作者：李文丽，海春旭，刘瑞，张晓迪，秦绪军 【关键词】 肝脏/ 损伤 【Abstract】 AIM: To study the liver injury and Kupffer cell (KC) changes induced by phosgene in mice. METHODS: Forty mice were randomly divided into 4 groups with 10 mice in each. The mice in control group were exposed to room air and the mice in posi
2、tive groups were exposed to 11.9 mg/L phosgene for 5 minutes, respectively. At the end of 2 hours, 4 hours and 8 hours after exposure to phosgene, all the mice were killed. The content of malondialdehyde (MDA) and reductive glutathion (GSH), and the activities of the total superoxide dismutase (TSOD
3、) in liver were detected. The histology and ultrastructure of the liver were observed 4 hours after the mice were poisoned with phosgene. RESULTS: Compared with those of control group, the MDA content significantly increased, the GSH content significantly decreased with the time prolonged, and the T
4、SOD activity significantly increased at 2 hours after phosgene exposure (P0.05). Hepatocyte was found with vacuolar 2degeneration under optical microscope, and increased lipid droplets in hepatocytes, live bleeding, and apoptosis of Kupffer cells were observed in poisoned mice under electron microsc
5、ope. CONCLUSION: Phosgene may induce hepatocytic oxidative injury, fat denaturalization and apoptosis of Kupffer cells in mice. 【Keywords】 phosgene; peroxides; liver/injury; mice 【摘要】 目的： 研究小鼠光气染毒对肝脏的损伤作用与枯否氏细胞的变化. 方法： 40 只小鼠，雌雄各半，随机分为 4 组. 正常对照组小鼠以空气为对照，染毒组小鼠给予 11.9 mg/L 剂量的光气，时间为 5 min, 染毒后 2, 4,
6、8 h，测定各组小鼠肝脏的丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（TSOD）活力、还原型谷胱甘肽（GSH）及染毒 4 h 后进行肝组织学和超微结构观察. 结果： 随着光气染毒后时间的延长，小鼠肝脏的 MDA 含量升高，GSH 含量降低，TSOD 活力在染毒后 2 h 显著升高，与正常组差异显著（P0.05） ；光镜下，光气染毒的肝组织肝细胞呈现空泡样变性. 电镜下，染毒肝细胞脂滴增多，肝脏出血，枯否氏细胞（KC）出现凋亡征象. 结论： 光气染毒可引起小鼠肝脏脂质过氧化，肝细胞脂肪变性、KC 凋亡. 【关键词】 光气；过氧化物；肝脏/损伤；小鼠 0 引言 光气(phosgene)作为重要的化工原
7、料，由其引发的中毒事故3时有发生1-3. 光气也是一种经典的窒息性毒剂，在第一次世界大战中就被使用. 光气中毒后可引发以肺水肿为主要症状的全身性改变，但中毒机制还不清楚. 由于光气的毒性大，需要特殊的实验室染毒条件和操作人员的自身防护，所以在我国研究光气中毒机制的文献不多，至于中毒后肺外器官的病理改变研究报道更少4. 在光气中毒的各种假说中，自由基损伤学说越来越受到重视. 因此，我们研究了小鼠光气染毒时间与肝脏的丙二醛（MDA） 、还原型谷胱甘肽（GSH）含量和总超氧化物歧化酶（TSOD）活力的关系，并对肺水肿小鼠的肝脏进行了光镜和电镜观察，以探讨光气中毒对肝脏的损伤，为临床防治提供依据. 1
8、 材料和方法 1.1 材料 二级昆明小鼠 40 只，雌雄各半，体质量 18.123.6 g，第四军医大学实验动物中心提供. MDA 标准品、硫代巴比妥酸系Merck 产品. 氯化硝基四氮唑蓝、牛血清白蛋白、邻苯二甲醛、GSH 和考马斯亮蓝 G250 由上海生物化学试剂进出口公司提供. 固体光气由润发化工有限公司生产. 仪器： 752 型可见分光光度计，上海医用仪器厂；970CRT 荧光分光光度计，上海三科仪器有限公司生产；LD42 型离心机，北京医用离心机厂 . JEOLJEMIOOSX 透射电镜，日本 JEOL 公司生产 . Portasens 气体检测仪，荷兰Analytical Tech
9、nology 公司生产.1.2 方法 1.2.1 动物分组与染毒 40 只小鼠随机等分为 4 组： 正常对4照组、染毒后 2, 4 和 8 h 组. 正常对照组小鼠以空气为对照，染毒组小鼠于染毒柜中给予 11.9 mg/L 剂量的光气，时间为 5 min. 1.2.2 指标测定染毒后 2, 4, 8 h 断头取肝脏. 右叶肝脏加生理盐水制成 15的匀浆液，3000 r/min 离心 10 min，取上清测定MDA 和 GSH 含量、TSOD 活性. 正常组和 4 h 组立即取左下叶切小米粒大的肝组织 20 g/L 戊二醛固定，其余用 40 g/L 的甲醛固定，进行透射电镜观察及常规石蜡包埋和
10、HE 染色. MDA 含量测定采用改进的硫代巴比妥酸荧光法，TSOD 活性测定采用改良盐酸羟胺法，GSH 含量采用改良荧光法. 统计学处理： 各组实验数据用 xs 表示，应用 SPSS10.0 统计软件进行单因素方差分析，P0.05 为有统计学意义 . 2 结果 2.1 光气染毒后不同时间小鼠肝脏 MDA, GSH 含量和 TSOD活力的变化小鼠给予 11.9 mg/L 剂量的光气后可见： 随着染毒后时间的延长，小鼠肝脏的 MDA 含量有升高趋势，8 h 组显著高于对照组（P0.05） ；染毒组小鼠 GSH 含量与对照组相比显著降低（P0.05） ；TSOD 活力在染毒后 2 h 组显著升高（
11、P0.05） ，4 h 开始下降，8 h 显著低于对照组（P0.05, Tab 1）.表 1 光气染毒后不同时间小鼠肝脏 MDA, GSH 含量和 TSOD 活力的变化（略） 2.2 光气染毒小鼠肝脏光镜病理改变光气染毒小鼠可引起肝5脏损伤，肝脏切片 HE 染色可见肝细胞有些肿胀，胞质可见空泡，血管有充血（Fig 1） . 2.3 光气染毒小鼠肝脏超微病理改变光气染毒小鼠肝细胞出现多种损伤(Fig 2)，脂滴增多，肝脏出血，枯否氏细胞(Kupffer cell, KC)胞核染色质聚集成团块，呈现凋亡征象(Fig 3). 3 讨论 光气的研究以往主要集中于它对肺脏的损伤5-7 ，本文针对光气引起
12、的肝脏损伤进行研究. 研究结果表明，光气染毒后 2 h， GSH 含量显著低于对照组. 随着染毒后时间的延长， GSH 含量也随之降低. 已经证实，光气能与组织大分子的亲核基团如氨基、羟基、巯基发生酰化反应，引起蛋白和脂肪变性、不可逆的膜结构改变、酶和其他细胞功能的破坏. 光气可耗竭肺组织的亲核成分，特别是 GSH8. 本实验在肝组织也验证了这一观点. MDA 是活性氧引起的脂质过氧化反应的终产物，是反映氧化损伤的可靠指标9. 实验中，肝脏 MDA 含量在染毒后 2 h, 4 h 未见明显升高，8 h 后显著高于对照组，提示光气染毒后可造成肝脏的氧化损伤，并且急性光气中毒早期测定肝脏的还原性
13、GSH 含量比 MDA 含量更加灵敏. Jaskot 等10研究表明，急性光气接触几天后，作为肺损伤的应激反应，肺组织的 SOD 增加. 本研究表明，光气染毒后 2 h，肝组织 TSOD 活性显著高于对照组，这可能正是肝损伤的应激反应所致. 实验中，光气染毒后 4 h，肝组织 TSOD 活性开始降低，GSH 含量继续降低；染毒后 8 h, TSOD 活性和 GSH 含量均显著低6于对照组. 此时的氧化性损伤可能是光气对肝脏的直接作用. 有研究报道5，11 ，光气暴露前或暴露后补充 GSH 上调剂和抗氧化剂丁羟茴醚及 N 乙酰半胱氨酸均能显著降低肺水肿的形成 . 从原理上看，这两种药物的作用机制
14、与其所具有的抗氧化特性有关，间接证明光气中毒存在氧化损伤. 因而，也可推测这两种药物也会对肝脏有保护作用，还有待于进一步研究证实. 本课题组已往研究表明，11.9 mg/L 的光气染毒 BALB/c 小鼠 5 min. 4 h 后肺脏出现了明显的肺水肿，说明我们建立的光气肺水肿小鼠模型是成功的12. 在生理状态下 ,KC 具有抗氧化酶系作用以清除超氧化基团和过氧化物，其中主要为 SOD、过氧化氢酶 (CAT)和还原型 GSH. KC 凋亡后，不仅产生过量自由基，而且抗氧化酶系也因过量消耗使活性降低，因而导致肝脏细胞的损伤. KC 作为肝脏主要的吞噬细胞，发挥清道夫的作用. 光气引发 KC 凋亡
15、，表明光气能够降低网状内皮系统的免疫功能，其确切机制值得深入研究. 我们的研究结果13提示： 光气中毒的患者，一方面要采取措施预防肺水肿的发生，另一方面也要对肝脏进行相应的保护. 本次研究弥补了这方面文献的不足，为进一步研究光气中毒肺外组织特别是肝脏的发病机制，以及针对 KC 损伤采取有效防护，对于光气中毒的防治等，具有重要的意义. 【参考文献】 71 杜桄，高繁标. 光气中毒 10 例报告J . 心血管康复医学杂志， 1999;8:33. Du G, Gao FB. Report of 10 cases phosgene of poisoning J. J Restorative Med C
16、ardio Vessel, 1999;8:33. 2 施玉兴. 抢救急性光气中毒一例体会J. 职业卫生与应急救援，2000;18:4. Shi YX. Rescuing 1 case phosgene of poisoning J. Occup Health Emerg Rescue, 2000;18:4. 3 王招兄，李思惠. 急性光气中毒 112 例临床分析J. 中国工业医学杂志，1998，11：165-166. Wang ZX, Li SH. Clinical analysis of 112 cases phosgene of poisoning J. Chin J Ind Med, 1998;11:165-166. 4 杜忠民，张金山，程飚. 家兔急性双光气中毒后肝组织超微结构的改变J. 第四军医大学学报，1991;12（1）：69-71. Du ZM, Zhang JS, Cheng B
