《P-糖蛋白在人乳腺癌细胞MCF-7ADM线粒体上的定位研究（毕业设计-妇产科学专业）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《P-糖蛋白在人乳腺癌细胞MCF-7ADM线粒体上的定位研究（毕业设计-妇产科学专业）（42页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华 中 科 技 大 学硕 士 学 位 论 文P-糖 蛋 白 在 人 乳 腺 癌 细 胞 MCF-7/ADM 线 粒 体 上 的 定 位 研 究姓 名 ： 楚 艳申 请 学 位 级 别 ： 硕 士专 业 ： 妇 产 科 学指 导 教 师 ： 王 泽 华20090501华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文P-糖蛋白在人乳腺癌细胞 MCF-7/ADM线粒体上的定位研究中文摘要目的：本实验以人乳腺癌细胞株 MCF-7 及 阿 霉 素 耐 药 株 MCF-7/ADM 为 研 究 对 象 ，建 立 分 离 纯 化 肿 瘤 细 胞 线 粒 体 的 方 法 ， 探 讨 多 药 耐 药 基 因 产 物
2、 P-糖 蛋 白（ P-glycoprotein， P-gp） 在 乳 腺 癌 细 胞 线 粒 体 上 的 定 位 与 表 达 ， 为 进 一 步 研 究 线 粒 体与 肿 瘤 细 胞 耐 药 、 抗 凋 亡 的 关 系 提 供 理 论 依 据 。方法：1 . 建 立 稳 定 传 代 的 抵 抗 阿 霉 素 的 人 乳 腺 癌 细 胞 株 MCF- 7/ADM,采 用 MTT 法 检测 细 胞 对 阿 霉 素 的 敏 感 性 ；2. 应 用 共 聚 焦 激 光 显 微 镜 (Confocal)检 测 乳 腺 癌 细 胞 株 MCF-7 及 阿 霉 素 耐 药 株MCF- 7/ADM 线 粒 体
3、 上 P-gp 的 定 位 ；3. 通 过 蔗 糖 密 度 梯 度 离 心 法 提 取 肿 瘤 细 胞 线 粒 体 ， 提 取 物 经 电 镜 鉴 定 ； 蛋 白 免疫 印 迹 法 (Western Blot)检 测 乳 腺 癌 细 胞 株 MCF-7 及 阿 霉 素 耐 药 株 MCF- 7/ADM 线 粒体 上 P-gp 的 表 达 。结果：1 . 成 功 建 立 了 对 阿 霉 素 耐 药 的 人 乳 腺 癌 细 胞 株 MCF-7/ADM， MTT 结 果 显 示MCF-7/ADM 对 MCF-7 的 耐 药 倍 数 为 65.12 倍 ；2. 免 疫 荧 光 共 聚 焦 激 光 显
4、微 镜 观 察 到 阿 霉 素 耐 药 株 MCF-7/ADM 中 P-gp 和 线粒 体 存 在 共 定 位 现 象 ；3. 电 镜 结 果 显 示 ， 提 取 得 到 纯 化 且 完 整 的 人 乳 腺 癌 细 胞 线 粒 体 ； 蛋 白 免 疫 印 迹结 果 亦 证 实 从 耐 药 株 MCF-7/ADM 中 提 取 线 粒 体 蛋 白 质 ， 在 分 子 量 170KDa 处 有 一 特异 性 条 带 。结 论 ： 蔗 糖 密 度 梯 度 离 心 法 可 用 于 制 备 肿 瘤 细 胞 线 粒 体 ； P-gp 表 达 于 阿 霉 素 耐 药 细 胞株 MCF-7/ADM 的 线 粒
5、体 上 ， 敏 感 株 MCF-7 未 见 P-gp 表 达 。 线 粒 体 P-gp 的 作 用 可 能是 在 亚 细 胞 水 平 介 导 肿 瘤 耐 药 。关键词 :P-糖 蛋 白 ； 多 药 耐 药 ； 线 粒 体 ； 亚 细 胞 定 位2华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文Mitochondrial Localization of P-glycoprotein in human breastcancer cell line MCF-7/ADMABSTRACTObjective： We carried out this experiment to establish the m
6、ethods of separation andpurification of mitochondria, in order to investigate the localization and expression ofmitochondrial P-gp in intact cells, as well as mitochondria isolated fromdoxorubicin-sensitive MCF-7 cells and their doxorubicin-resistant counterparts.Methods: To establish stable MCF-7 c
7、ell lines resistant to doxorubicin .The resistanceindex of MCF-7 cells were assessed by MTT assay. In situ analysis of P-gp expression wasdetermined by confocal laser scanning microscopy. Mitochondria was prepared by meansof density gradient centrifugation. Western blot was also carried out on whole
8、 cell andisolated mitochondria from MCF-7 cell lines.Results: MTT verified the MCF-7/ADM cells were 65.12-fold resistant to doxorubicincompared with the parental cell line. Confocal microscopy demonstrated the presence ofmitochondrial P-gp in doxorubicin-resistant MCF-7 cells. Western blot analysis
9、revealed asingle band of 170-KDa in mitochondria prepared from doxorubicin-resistant MCF-7 cells.Conclusion: The protocols in this unit can be used as rapid methods for the preparation ofmitochondria from cultured cells of human breast cancer cell line.These findings indicatethat P-glycoprotein is e
10、xpressed in mitochondria of doxorubicin-resistant MCF-7 cells andcould be involved in drug resistance at this sub-cellular site.Keywords: P-glycoprotein; Multidrug-Resistance; mitochondria; sub-cellular localization3华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文英文缩略表及中文对照英 文 缩 略 英 文 中 文 对 照ADM Adriamycin 阿 霉 素BSA Bovine S
11、erum Albumin 牛 血 清 白 蛋 白CsA Cyclosporin A 环 孢 素 ADMSO Diamthylsulfoxide 二 甲 基 亚 砜DNR Daunorubicin 柔 红 霉 素ECL Enhanced chemiluminescence 增 强 化 学 发 光IC50 50%inhibitory concentration 50%抑 制 浓 度Kda Kilodalton 千 道 尔 顿MCF-7 人 乳 腺 癌 敏 感 细 胞 株MCF-7/ADM 人 乳 腺 癌 耐 药 细 胞 株MDR multidrug resistance 多 药 耐 药MDR-1
12、multidrug resistance-1 药 耐 药 基 因Min Minute 分 钟mtDNA mitochondria DNA 线 粒 体 DNAMTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)diphenyl 甲 基 偶 氮 唑tetrazolium bromidePBS Phosphate balanced solution 磷 酸 盐 缓 冲 液P-gp P-glycoprotein P-糖 蛋 白RI resistance index 耐 药 指 数RPMI1640 RPMI1640 培 养 基rpm Round per minute 每 分 钟 转 数SDS
13、 Sodium Dodecyl sulfate 十 二 烷 基 磺 酸 钠1。 细 胞 器 P-gp 可 能 与 质 膜 P-gp 一 样 在 肿 瘤 耐 药 中 发 挥 着 重 要 作 用 。华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文P-糖蛋白在人乳腺癌细胞 MCF-7/ADM 线粒体上的定位研究前 言化 疗 药 物 治 疗 是 当 今 肿 瘤 治 疗 的 关 键 手 段 之 一 ， 肿 瘤 细 胞 对 抗 癌 药 物 的 耐 药 问 题是 导 致 化 疗 失 败 的 常 见 因 素 和 关 键 性 难 题 。 肿 瘤 化 疗 失 败 的 主 要 原 因 是 肿 瘤 细 胞 的 多药 耐
14、 药 (multidrug resistance ,MDR)。 多 药 耐 药 的 提 出 早 在 20 世 纪 70 年 代 ， 它 是 指 肿瘤 细 胞 接 触 某 一 种 抗 癌 药 物 产 生 耐 药 的 同 时 ， 也 对 非 同 类 结 构 、 细 胞 靶 点 和 作 用 机 制迥 然 不 同 的 其 他 化 疗 药 物 产 生 交 叉 耐 药 1。 因 此 ， 探 索 多 药 耐 药 机 制 是 解 决 耐 药 问 题 、改 善 化 疗 效 果 的 关 键 。大 量 的 研 究 表 明 MDR 的 形 成 是 多 因 素 多 基 因 共 同 作 用 的 结 果 ， 经 典 的 耐
15、 药 标 志蛋 白 如 P-糖 蛋 白 （ P-glycoprotein， P-gp） 、 多 药 耐 药 相 关 蛋 白 （ Multidrug resistanceassociated protein, MRP） 、 肺 耐 药 相 关 蛋 白 ( Lung resistance- related protein, LRP） 、乳腺 癌 耐 药 相 关 蛋 白 (Breast cancer resistance protein, BCRP)、 DNA 拓 扑 异 构 酶 II（ topoisomerase,topoII） 等 生 化 因 素 的 异 常 使 得 细 胞 内 药 物 浓 度
16、降 低 ， 导 致 了 肿 瘤 细胞 MDR 的 形 成 。 在 众 多 的 MDR 机 制 中 最 重 要 、 研 究 相 对 透 彻 的 当 属 MDR 基因及其编 码 的 相 关 蛋 白 ， 即 人 类 MDR1 基 因 的 高 表 达 ， 及 其 编 码 产 物 P-gp 量 的 增 加 。 P-gp为 ABC 转 运 蛋 白 超 家 族 的 代 表 之 一 ， 是 由 1280 个 氨 基 酸 组 成 的 跨 膜 磷 脂 糖 蛋 白 ， 分子 量 为 170KD，故又称为 P-170。 P-gp 能 够 转 运 多 种 结 构 功 能 互 不 相 同 的 化 学 药 物 ，如 长 春 新 碱 、 阿 霉 素 和 紫 杉 醇 等 ， 导 致 细 胞 内 药 物 浓 度 的 降 低 和 细 胞 毒 作 用 的 减 少 2。P-gp 被 认 为 是 一 种 “疏 水 真 空
