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1、蛋白甲基转移酶在神经细胞发育中的作用探讨蛋白甲基转移酶与果蝇zeste 基因增强子同源,是多梳蛋白抑制复合物 2蛋白复合物的一个催化亚基,通过 SET结构域催化组蛋白H3赖氨酸第27号位的三甲基化,进一步介导转录抑制1.其在疾病尤其是肿瘤发生发展中的作用已经得到共识,成为当前研究的热点.研究表明,EZH2的过表达在许多不同类型的肿瘤中发现,比如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等,与肿瘤的侵袭、演化以及不良预后有关2-5.在血液系统肿瘤中,EZH2的过表达已经在成人 T细胞白血病淋巴瘤、Burkitt s淋巴瘤、TNK 细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、B 细胞急性淋巴细胞白血病、弥漫大B
2、细胞淋巴瘤等多种淋巴系统肿瘤中被证实6-9.在神经系统肿瘤中,EZH2与神经胶质瘤,恶性外周神经鞘膜瘤等肿瘤的发生发展、分级及治疗密切相关9-10.尽管 EZH2 在神经系统肿瘤中意义重大,EZH2致肿瘤发生的作用机制大部分仍不清楚,目前的国内外基础研究也相当有限.我们成功建立了小鼠胚胎干细胞体外分化体系,观察 EZH2 在胚胎干细胞诱导分化为神经细胞过程中的蛋白表达变化,为以后对 EZH2 蛋白功能与作用机制的进一步研究提供依据.1 材料和方法1.1实验细胞系小鼠胚胎干细胞系 E14Tg2A.4.1.2 主要试剂、仪器设备及来源明胶;DMEM培养基;胎牛血清;非必需氨基酸;2-巯基乙醇;L-
3、谷氨酰胺;核苷酸;青霉素-链霉素;1000UmL 血病抑制因子;胰酶;DMSO;DPBS;维甲酸;逆转录酶试剂盒;Taq酶,FastGreenMaste;BCA蛋白浓度测定试剂盒;超敏ECL 化学发光试剂盒;EZH2 一抗;EZH2二抗;荧光定量 PCR仪;ECL 化学发光;倒置显微镜;Westernblot 所用电泳仪等为Bio-rad 公司生产;显影设备为ImageQuantLAS4000系统.1.3RA 诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化实验 E14Tg2A.4培养在预铺有明胶涂层的细胞培养皿中,加入DMEM完全培养基:80%DMEM 培养基,15%胎牛血清,1%非必需氨基酸,1%2-巯基
4、乙醇,1%L-谷氨酰胺,1%核苷酸,1%青霉素-链霉素,1000UmL 血病抑制因子.在铺有明胶的10m 培养皿中,DMEM完全培养基培养 2d 后,收集细胞1.5 106,将细胞沉淀标记为第0 天,同时按照1.5 10610m 培养皿的密度种植于5 个10m 细胞培养皿,在撤去LIF 的DMEM完全培养基中加入维甲酸进行诱导,其间每天换液,第5 天诱导结束.于诱导分化第 1天、第 2天、第 3天、第 4天、第 5天收集细胞沉淀,标号.细胞培养期间每天倒置显微镜下观察细胞形态,并拍照保存.1.4RT-PCR在干细胞分化过程中,按固定时间收获细胞,用 TRN2ol试剂提取 RNA,然后用Supe
5、rSriptIII 逆转录酶,oligo 作为引物合成DNA,用SYBRgreen 法作定量 PCR反应.1.5Westernblot将收获的D0至 D5 细胞沉淀,用 RIPA 裂解法制备全细胞裂解液,超声破碎,测蛋白浓度,按照60 g的上样量进行Westernblot,用 SDS-PAGE 蛋白电泳法分离蛋白,用湿转膜的方法把蛋白转移到硝酸纤维素膜上,3%脱脂牛奶室温封闭1h,一抗室温孵育1h,TBST洗 3次,5min次,然后二抗孵育1h,TBST 洗3 次,5min 次,ECL化学发光,孵育 5min,ImageQuantLAS4000 系统显影,应用ImageQuantTL软件分析图
6、像,计算相对蛋白含量.1.6统计学处理对各组的计量数据用均数 标准差表示.用SPSS17.0软件统计包进行统计,多组间的比较采用方差分析,总体差异显著后,进行 PostHo 两两比较.P 0.05为差异有统计学意义.2结果1胚胎干细胞诱导分化过程中细胞形态上的变化形态学观察可见,胚胎干细胞呈椭圆或圆形,细胞核大,核仁明显.加入RA诱导1d后,细胞逐渐变为三角形或多边形向外扩展,随后的几天开始伸出突起,变细变长,与邻近细胞交织成网,在诱导5d后,形成密集的神经样网络,神经样细胞多呈双极性,胞体圆亮.整体来看,细胞形态已趋于一致.见图1.2Real-TimePCR验证胚胎干细胞标记物和神经细胞早期
7、分化标记物结果胚胎干细胞标记 Sox2、Ot34、Nanong 在诱导过程中 mRNA 表达水平大幅度下降,神经细胞早期分化标记物Nestin、Tuj1、NeuroD、Nestin在诱导过程中mRNA表达水平大幅度上升.结合从细胞形态学变化和 Real-TimePCR 分析结果,确定小鼠胚胎干细胞向神经细胞诱导分化成功.见图 23.3 胚胎干细胞向神经细胞分化过程中EZH2蛋白表达水平变化EZH2在小鼠胚胎干细胞中蛋白表达水平比较高.在撤去LIF 加入 RA 诱导向神经干细胞分化 1d 后,EZH2 表达水平仍然较高.在RA的持续作用下从第2 天开始EZH2表达水平逐渐下降,在第 5天降至最低.见图4 5.3讨论本实验成功诱导了小鼠胚胎干细胞向神经细胞的分化,并且观察到EZH2蛋白在小鼠胚胎干细胞中表达水平比较高,在撤去LIF 加入 RA 诱导向神经胞分化 1d 后EZH2表达水平仍然较高,在RA的持续作用下从第2 天开始EZH2表达水平逐渐下降,在第 5天降至最低的变化.总的来说,本实验建立了小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的体系,观察到与神经发育疾病相关的 EZH2 蛋白在神经细胞发育过程中的特异性表达变化,为下一步研究EZH2的作用机制打下了基础.
