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1、,质粒构建,产生cDNA,细菌培养,纯化蛋白质,蛋白结晶,核磁共振实验,X射线衍射实验,实验数据分析,蛋白质结构,原始基因数据,生物信息学分析,选择基因,生物膜,生物膜是细胞的主要组成部分，具有独特的结构和功能。已知真核细胞除了有包围整个细胞的质膜外，还有构成各种细胞器的细胞器膜。真核细胞的膜占整个细胞干重的70-80%。这些膜结构对细胞内环境的稳定、物质代谢、能量转换、信息传递等许多方面都起着极为重要的作用。,离子通过膜的运送,物质在生物体内有两种运送方式。一种是随体液流动，另一种是通过生物膜的运送，后者又称为跨膜运送。生物膜是细胞和各种细胞器的屏障。它可以选择性的允许一些分子通过。通过生物
2、膜除了可以摄取和浓缩必需的物质外，还要排出无用或多余的物质。生物膜还可以保持膜内外某些离子的浓度梯度 ，保证生物信息的有效传递。生物膜的运送体系可以识别它运送的物质并控制通过的数量。,离子跨膜运送的方式,生物膜运送离子的方式大致可分为两类：被动运送和主动运送。1.被动运送：离子沿化学势的方向进行运送，即离子从浓度大运送到小的一侧。这个过程不消耗能量。被动运送又分为简单扩散和促进运送。,简单扩散：离子依赖浓度梯度和电位梯度通过生物膜，它遵循运送速度与浓度梯度成正比的扩散定律。金属离子的简单扩散困难，因它们难以通过膜的疏水内层。,2.主动运送：主动运送是离子逆浓度梯度和电化学梯度通过生物膜的运动，
3、这个过程需要能量。主动运送也需要离子载体或蛋白质的帮助。执行主动运送的机制常被称为离子泵，它能维持膜内、外离子成分和浓度的稳定。如细胞外液Na+ 浓度高于内液，而K+则相反；离子泵仍不断将细胞内Na+排出，细胞外K+运入细胞内，以保持细胞内的低Na+ 高K+环境。,钠、钾和氯离子的主要功能是调节体液的渗透压，电解质的平衡和酸碱平衡，通过钠-钾泵， 将钾离子、葡萄糖和氨基酸输入细胞内部，维持核糖体的最大活性，以便有效地合成蛋白质。钾离子也是稳定细胞内酶结构的重要辅因子。同时，钠离子、钾离子还参与神经信息的传递。,罗德里克 麦金龙Roderick MacKinnon,2003 诺贝尔化学奖,钙结合
4、蛋白,许多生理过程都与Ca2+离子有关。如激素分泌、DNA合成、细胞分裂、肌肉收缩等。对于Ca2+的作用，直到70年代发现钙结合蛋白、特别是钙调蛋白(calmodulin,CaM)之后，这个问题才有了答案。现已知钙调蛋白作为细胞内Ca2+的受体蛋白，其分子内有几个结合Ca2+的位点，这些结合点中任何一个与Ca2+结合之后，均可能发生构象变化，从而参与协调细胞各种依赖Ca2+的生理过程。,钙调蛋白的结构 钙调蛋白的一级结构：钙调蛋白由一条多肽链构成。牛脑CaM的相对分子量为16700，多肽链由148个氨基酸残基组成，整个分子含4个Ca2+离子。CaM的一级结构在进化上表现出罕见的保守性，因此也就
5、缺乏物种特异性和组织特异性。原生动物（如梨形四叶虫）CaM与脊椎动物CaM相比，只有11个氨基酸残基不同，1个缺失。,1985年Y.S.Babu等对CaM 晶体的x射线结构分析证明，整个分子形状像一个哑铃，长6.5nm，柄是一段长螺旋，每个铃含两个Ca2+离子，两个Ca2+的间距为1.13 nm。Ca2+与主链羰基氧及酸性残基侧链氧配位。每个铃中两个钙结合环之间有氢键相互作用。,它形如右手伸开的拇指和食指及握紧的中指，Kretsinger称为E-F手结构。根据这种结构模型，钙调蛋白CaM有4个区，每个区都是一个E-F手结构。,钙结合到EF-手蛋白，而不是其它离子，如Mg(II), Na(I),
6、 K(I)等? 软硬酸碱效应：钙离子是硬酸，而EF-手蛋白的配位原子全是含氧配体EF-手蛋白的配体的配位数是7，高配位数倾向于较大的钙离子,铁（II，III）的主要功能是作为机体内运载氧分子的呼吸色素:例如，哺乳动物血液中的血红蛋白和肌肉组织中的肌红蛋白的活性部位都由铁（II）和卟啉组成。其次，含铁蛋白（如细胞色素、铁硫蛋白）是生物氧化还原反应中的主要电子载体，它是所有生物体内能量转换反应中不可缺少的物质。,含铁蛋白质,天然氧载体 生物体内的天然氧载体具有可逆载氧能力，能把从外界吸收入的氧运送到身体的各种组织， 供细胞内进行维持生命所必需的各种氧化作用。按照蛋白质载氧的活性部位的不同，可把天然
7、氧载体分为三类：含血红素辅基的蛋白（heme）： 血红蛋白(hemoglobin) 肌红蛋白(myoglobin)不含血红素的铁蛋白： 蚯蚓血红蛋白(hemerythrin)含铜的蛋白：血蓝蛋白 (hemocyanin),天然氧载体的若干性质,正常人的红细胞里含有两种血红蛋白分子。一种为两个亚单位和两个亚单位（22），占血红蛋白总量的95%，另一种为22，占血红蛋白总量的5%。亚单位有141个氨基酸残基，和含146个氨基酸残基。这些亚单位有75%左右的部位形成-螺旋结构，主要分成八个螺旋区，用A B C D E F G和H标记。两个螺旋区之间存在长短不一的非螺旋区，以AB,BC,CD,DE,E
8、F,FG,和GH标记。每个亚基单位都键合着一个亚铁卟啉辅基（血红素辅基）。,亚单位是通过氨基酸链的第87位组氨酸残基的侧链的咪唑氮原子与Fe()配位键合，而链则通过第92位组氨酸残基侧链的咪唑氮原子相连于Fe()。整个Fe()卟啉辅基被包围在或亚单位形成的口袋状空腔中。 肌红蛋白是由一条有153个氨基酸残基形成的多肽链构成，相对分子量17500。多肽链第93位组氨酸残基的侧链的咪唑氮原子与Fe()卟啉辅基的Fe()配位。第6个配位位置一般由水分子占据，氧合时则由氧分子取代水分子。,血红素被肽链包围，形成疏水环境，使Fe()（在血红蛋白和肌红蛋白中）保持Fe()氧化态存在，这对可逆载氧或贮存氧具
9、有重要意义。如血红素中Fe()被氧化为Fe()（在血红蛋白中称为高铁血红蛋白），则失去载氧或贮存氧功能。但在细胞里，存在大量还原物质，如NADPH2（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）、抗坏血酸等，可将Fe()还原为Fe()。,脱氧血红蛋白,氧合血红蛋白,脱氧和氧合血红蛋白的三级结构,血红素与氧结合或解离时的三级构象改变,铁硫蛋白,传递电子，参与生物体内各种氧化还原反应为一类含FeS发色团的非血红素铁蛋白，利用铁的可变价，进行电子传递作用。根据氧化还原反应中心的组成和结构，铁硫蛋白可分为三大类： 1. Fe(Cys)4 蛋白； 2. Fe2S*2(Cys)4蛋白； 3. Fe4S*4(Cys)4蛋白.
10、 (Cys-半胱氨酸),铜（I、II）的主要功能与铁相似，起着载氧色素（如血蓝蛋白）和电子载体（如铜蓝蛋 白）的作用。另外，铜对调节体内铁的吸收、血红蛋白的合成以及形成皮肤黑色素、影响结缔组织、弹性组织的结构和解毒作用都有关系。,存在于软体动物（章鱼 ，乌贼，蜗牛）和节足动物（螃蟹，虾，蜘蛛等）的血液中。血蓝蛋白是以一价铜（Cu+）为辅基的蛋白。亚基数可变，每个亚基均含两个Cu+，相对分子量是5000074000。血蓝蛋白的生理功能是输氧。氧合血蓝蛋白的铜是Cu()，呈蓝色，脱氧血蓝蛋白的铜是Cu（），无色。,含铜蛋白,氧合和释氧可表示为 2 Cu（）+ O2 Cu2 O2,氧合和释氧可表示为 2 Cu（）+ O2 Cu2O2,维生素B12和辅酶B12,维生素B12是重要的含钴的生物化合物，是天然存在的最复杂的配位化合物之一。存在于动物体及细菌中，动物体内维生素B12是从食物中来，另外肠道细菌也可合成vitamin B12，人和动物本身不能合成维生素B12，维生素B12治疗恶性贫血有效。多萝西在1964年被授予诺贝尔化学奖,
