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1、植物单细胞培养概论,一、植物单细胞培养相关概念,1、植物的单细胞培养： 在适宜的条件下，一个来自已分化的根、茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以发育成同其亲本一样的完整植株。 植物组织培养技术的重要理论基础是植物细胞的全能性 植物的单细胞培养，在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整个植株的技术。,2、愈伤组织： 原指植物体受伤时产生于伤口周围的组织。现多指切取植物体的一部分，置于含有生长素和细胞分裂素的培养液中培养，诱导产生的无定形的组织团块。 3、外植体： 把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体,愈伤组织例图,二、植物组织培养特
2、点及其意义,特点： 培养条件可以人为控制 生长周期短，繁殖率高 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制意义：研究细胞生理代谢过程及各种影响因子； 用于植物品种的改良； 用于植物次生代谢物质的生产,三、细胞培养的主要内容,1、单细胞培养（Single cell culture）2、悬浮培养（Suspension culture ）3、细胞培养实验室器材 简介,第一节：单细胞培养 （Single cell culture）,单细胞的分离单细胞的培养方法影响单细胞培养的因子,单细胞的分离,从外植体中直接分离单细胞从愈伤组织中分离单细胞通过原生质体再生法获取单细胞,* 叶片是分离单细胞的最好材料 *,机
3、械法：第一种方法：用刀片刮叶片 第二种方法：叶片研碎、离心 酶解法：,机械法第一种方法： 用刀片刮叶片,机械法第二种方法：叶片研碎、离心,酶解法,Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞,从愈伤组织中分离单细胞 将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团伙单细胞，然后用适当孔径的细胞筛过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。,通过原生质体再生法获取单细胞 外植体、愈伤组织或细胞团通过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁得到原生质体。,单细胞培养培养方法,液体浅层培养法固体平板培养法看护培养法微室培养法,1、液体浅层培养法,将悬浮在培养液中
4、的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团,用途：主要用来增殖细胞。,特点：,有利于有毒物质的扩散；有利于气体交换；不利于定点观察；单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。,2、固体平板培养法,2-1 含义及用途：含义： 是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。该方法是Bergmann(1960年)首创。 用途：是为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。,2-2 特点,操作简便；分离单细胞系比液体浅层培养容易；培养细胞气体交换不畅。,固体培养基,2-3 平板培养的基本技术 (1)、培养基配
5、制 1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。（2）悬浮细胞密度的调制 平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为110 10010 个/ml 。初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。,调制方法：若悬浮液中细胞密度高，则加培养液稀释；若悬浮液中细胞密度过低，则通过离心使细胞沉淀后，取一定量的上清液使其达到所要求的密度。,若悬浮液与培养基以1:4混合，则应把悬浮液的细胞密度调到 510 50010 个/ml。,（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板，盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。
6、(4) 培养： 26置暗处培养21天。低倍显微镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。,植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。 植板效率= 100%,该平板上接种的细胞数,每个平板上形成的细胞团数,2-4 平板培养必须注意的方面,（1）选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在低的初始植板密度下使细胞生长。（2）不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高的植板率。（3）在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不同。如：烟草细胞适宜的为510 10 个/ml,若低于此数则植板率显著下降。
7、（4）接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 。,3、看护培养法,3-1 看护培养的含义及用途含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。用途；诱导形成单细胞系。Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。,看护培养（Nurse culture）图示：,单细胞无性系,恒温培养1个月,23月,用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织,3-2 看护培养基本技术,（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。（2）在无菌的条件下
8、，先将一小块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。（3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。（4）恒温培养。,3-4 特点： 1）效果好，易于成功。 2）简便易行。 3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。 注意：要得到单细胞系必须保证接种材料是真正的单细胞。,4-1 微室培养的含义及用途,含义：即将细胞培养在很少量的培养基中。用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。,4、微室培养法,微室培养（Microculture）图示：,1滴含单细胞培养液,周围加石蜡油,凹穴载玻片,旁边加石蜡油,盖盖玻片,盖盖玻片,
9、置培养皿中2628 恒温培养,4-2 微室培养特点：培养基用量少可通过显微镜观察单个细胞的生长分裂、发育状况有利于对细胞特性和单个细胞的生长发育的全过程进行跟踪研究4-3 微室培养要求： （1）微室内不能有气泡。（2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖 玻片 的厚度要在0.170.18毫米左右。（3）观察时要保持温度和培养时的一致。,植板密度较高时，与悬浮培养中或愈伤组织中相似的培养基即可；较低时，则成份非常复杂，可加入椰子汁，水解酪蛋白或酵母浸出液等化学不明确物质；,1、培养基成份2、初始细胞植板密度(临界密度),三、影响单细胞培养的因子,临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞
10、就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在1000个细胞以上。其他：植物生长激素、温度、PH、二氧化碳含量等,第二节：细胞悬浮培养 Suspension culture,特点：细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。,概念：是指离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行无菌培养。由愈伤组织液体培养技术发展而来。,1、起始悬浮液的制备,2、悬浮培养的基本形式,分批
11、培养连续培养,2-1、分批培养（Batch culture）,2.1.1 含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。,2.1.2 特点,培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目 不断发生变化，呈S增长。 必须适当搅拌,2-2 连续培养（Continuous culture),2.2.1 含义：是相对分批培养而言的。连续培养是采用有效的措施让微生物在某特定的环境中保持旺盛生长状态的培养方法. 2.2.2 特点:：高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减
12、少了非生产时间和提高了设备的利用率；自控，便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量较稳定；节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。,第三节 细胞培养实验室器材 简介,1.灭菌设备：高压蒸气灭菌锅用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。工作原理：在密闭的蒸锅内，01MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。,2.接种设备：无菌超净工作台用于培养材料的消毒及接种。使用前，将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启，灭菌15min后，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在上面进行操作。,电炉,推车,酒精灯,封口膜,接种器具,灭菌器,培养瓶,3.培养设备带日光灯的培养架，主要用于接种后材料的培养。,恒温箱：又称培养箱，可用于原生质体和酶制剂的保温，也可用于组织培养材料的保存及暗培养。,摇床与转床：在液体培养基中，可改善培养基中的培养材料的通气状况。如从疏松的愈伤组织中获得单个细胞。但注意要设定适合的温度及转速。,thats all!,
