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1、1乙型肝炎病毒血清学标志物（HBV-M）的检出及应用HBV 是乙型肝炎的病原体，乙型肝炎患者潜伏期、急性期及乙型肝炎病毒携带者的血液具有高传染性，接触极微量的（10-710-6ml）的血液即可引起感染。乙型肝炎危害极大，约 10%的乙型肝炎转变为慢性肝炎（CH） ，部分慢性活动性肝炎（CAH）转变为肝癌（HCC） 。婴幼儿感染 HBV 易形成持续病毒携带者，HBV 病毒携带者发生原发性肝癌的危险性更大。而我国又是乙型肝炎高感染国家，据统计，全国人口 10%以上为 HBsAg 携带者，乙型肝炎病毒的总感染率为 35.5%61.1%。由于可进行定量分析，对药物疗效和病情监测都具有重要意义。本实验用
2、三种不同的方法检测了HBV-M，旨在探讨三种方法在日常生活工作中的可行性与相关性。现将实验结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 健康人血清采用 TRFIA、MEIA、ELISA 对 200 例健康职工经 HBV-M 五项指标做定性（量）分析，随机抽取 50 例作为正常对照，年龄 145 岁。 1.1.2 乙型肝炎患者血清用 TRFIA、MEIA、ELISA 对 50 例强阳性或临界值血清样本做 HBV-M 五项指标检测，年龄 1/12 岁81 岁。21.1.3 质控血清卫生部临检中心质量控制血清浓度分别为：0.2ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/m
3、l,5.0ng/ml ；内蒙古临检中心质控血清：0.3ng/ml,1.0ng/ml,2.0ng/ml，5.0ng/ml。 1.2 诊断试剂、仪器与方法 1.2.1 诊断试剂与仪器 TRFIA 分析法使用上海新波生物技术有限公司生产的 ANYTEST2000 型时间分辨荧光免疫检测系统和 SYM-BIOBGATE2310 全自动微孔洗涤机及配套试剂。MEIA 分析法使用美国 Abbott 试剂和 AXSYM 全自动酶免发光分析系统；ELISA 法使用北京万泰药业公司及 3V 公司生产的试剂。洗板机为天石医疗用品制作所 ZMX-998B 型自动酶标洗板机；酶标仪为奥地利CliniBio128C 自
4、动酶标仪和SHANDONGGAOMICAIHONGANALYTICALINSTRUMENTSCO.LTD 的 GF-M2000MICROPLATEREADER。 1.2.2 方法 TRFIA（ Timeresolvedfluoroimmunoassay，时间分辨荧光免疫技术）技术是以镧系元素铕化合物作为荧光标记物，利用这一荧光物质有长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再进行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异本底荧光的干扰，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了
5、光学分析的灵敏度。 2 结果与分析 32.1TRFIA 和 ELISA 检测定性结果分布得出 HBsAg：灵敏度 48/（48+1 ）100%=97.96%，特异性50/（50+1）100%=98.04%，诊断符合率 98.00%；同理：HBsAb：灵敏度为 93.47%，特异性 81.48%，诊断符合率97.00%；HBeAg：灵敏度为 96.55%，特异性 97.18%，诊断符合率 97.00%；HBeAb：灵敏度为 90.91%，特异性 89.74%，诊断符合率 90.00%；HBcAb：灵敏度为 95.92%，特异性 92.16%,诊断符合率 94.00%。 2.2TRFIA 和 ME
6、IA 检测定性结果分布 TRFIA 和 MEIA 检测定性结果分布得出 HBsAg 灵敏度 48/（48+1 ）100%=97.95%；特异性51/（51+1）100%=98.08%；诊断符合率 98%；同理：HBsAb：灵敏度为 100%，特异性 85.45%，诊断符合率92%；HBeAg：灵敏度为 96.97%，特异性 98.57%，诊断符合率98.00%；HBeAb：灵敏度为 95.83%，特异性 93.42%，诊断符合率 94.00%；HBcAb：灵敏度为 98.00%，特异性 96.00%，诊断符合率 97.00%。 2.3ELISA 和 MEIA 检测定性结果分布 ELISA 和
7、MEIA 检测定性结果分布得出 HBsAg：灵敏度 49/（49+0 ）100%=100%；特异性51/（51+0）100%=100%；诊断符合率 99.00%；同理：HBsAb：灵敏度为 100%，特异性 98.18%，诊断符合率499.00%；HBeAg：灵敏度为 96.67%，特异性 98.57%，诊断符合率 98.00%；HBeAb：灵敏度为 91.67%，特异性 100%，诊断符合率 98.00%；HBcAb：灵敏度为 98.00%，特异性 100%，诊断符合率 99.00%。 2.4 分析比较 2.4.1 当 CUTOFF 值设置为0.3ng/ml 时，HBsAg ：TRFIA1
8、例阳性，表现为“小三阳” ，而 ELISA 阴性，其浓度为 0.4ng/ml，结果仅为 HBeAb 和 HBcAb 阳性，提示 TRFIA 由于相对敏感而检出，而 MEIA 与 TRFIA 基本一致。但就临界标本而言，TRFIA、ELISA、MEIA 均存在一定的假阳性率、假阴性率分别为1.96%、2.04%。就随机样本而言，ELISA、MEIA 则 HBsAg 较易出假阳性、假阴性反应。实际工作中 HBsAg 的 CUTOFF 值设为0.5ng/ml。 2.4.2 当 CUTOFF 值设置为0.03NCU/ml 时，TRFIA 法HBeAg2 例阳性，而 ELISA 阴性，经过综合分析，这
9、2 例为真阳性。而 MEIA 仅有 1 例阳性，说明三种方法均有一定的漏检 TRFIA 法测HBeAg 灵敏度、特异性、结果符合率就随机样本而言，要高于ELISA、MEIA 。因本项目标本所选取大多为强阳性标本，故其灵敏度、特异性、结果符合率基本一致。 2.4.3 当 CUTOFF 值设置为10mIU/ml 时，HBsAb 三种方法均很好，阳性符合率都很高；当 CUTOFF 值设置为1.5NCU/ml 时，HBeAb 三种方法阳性率也都很高。但就临界标本而言，ELISA 和5MEIA 出现假阳性和假阴性反应要高于 TRFIA 法且易漏检。 2.4.4 当 CUTOFF 值设置为0.095NCU
10、/ml 时，HBcAb：TRFIA1 例假阳性，ELISA1 例假阴性，三者符合率很高。这样（血清标本分别进行 20 倍、30 倍稀释）检测结果基本符合HBV 感染后的血清学标志物模式。 2.4.5 三种方法阴阳结果经配对资料的卡方检验，差异均无显著性（P 0.05） 。就随机样本而言，三种方法结果符合率都很高，就临界值样本，ELISA 和 MEIA 假阴性、假阳性反应明显高于 TRFIA 法；灵敏度和特异性普遍低于 TRFIA 法。究其原因，可能与前两种方法与 TRFIA 法反应原理不同有密切关系。 3 应用 3.1TRFIA 定量检测 HBV-M（俗称乙型肝炎两对半）临床应用及意义血清乙型
11、肝炎五项标志物定性测定始于 80 年代中期,对乙型肝炎的疾病诊断,病程监测, 疗效观察起到了一定的作用。随着临床医学的迅速发展,定性检测已远远不能满足临床及患者的要求。由于受检测抗原抗体“定性”结果不是“阴性”就是“阳性”,只能作程序式的、机械的判断,对某些结果不能做出合理的解释且存在较大缺陷,无法动态观察病情和疗效变化,为临床所提供的信息有限。随着临床医学检验中新型标记方法的建立(如用镧系元素的原子作为标记物的时间分辨荧光分析技术),乙型肝炎五项病毒指标定量测定成为可能，大大弥补了酶标（ELISA ）定性测定的不足之处。 3.1.1TRFIA 检测 HBsAg 灵敏度可达 0.0625ng/
12、ml（至少60.2ng/ml） ，而 ELISA 检测 HBsAg 灵敏度是 0.5ng/ml（甚至达2ng/ml） ，也即只有血清中 HBsAg 的达到 0.5ng/ml 酶标才会呈阳性。而两对半定量五项指标 TRFIA 的综合应用较以往定性检查更加灵敏准确。 3.1.2 动态观察疗效和病情监测病情的发生、发展、疗效、预后是一个动态变化的过程，定量检测 HBV-M 各项标志物的浓度变化可对乙型肝炎的病程、治疗、预后能起到一个全程动态检测的作用，能够为医生对病情疗效做出合理的解释提供依据，指导治疗。3.2TRFIA 和定量 PCR 技术互相补充尽管 HBV-DNA 定量 PCR 测定可以直接反
13、映血液中病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但并不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内 HBV 病毒状态。HBV-DNA阴性并不能完全代表体内 HBV 已被清除，结合 HBV-M 五项指标更能客观反映体内 HBV 病毒状态，正确判断预后和治疗。如果 HBV-DNA 阴性而 HBsAg、HBeAg 或 HBeAb 及 HBcAb 浓度还较高，提示并未完全痊愈，有可能病毒再次出现复制状况，尚须密切关注。如果 HBV-DNA 阴性而 HBsAg、HBeAg 或 HBeAb 及 HBcAb 浓度均很低或阴性并持续一段时间，提示可能完全痊愈，预后效果良好。乙型肝炎患者进行抗病毒治疗时，血清中的病毒核酸含量是
14、反映病毒数量和复制活跃程度的最可靠的直接指标，因此，病毒含量的检测显得必不可少，是能确实反映动态观察药物疗效的确切指标，特别是对于 HBeAg 阴性的患者。但长期应用贺普丁治疗 HBV-DNA 阳性的患者必须应用 PCR 来测定是否产生 YMDD 变异，但采7用测序方法操作繁琐而且成本高，不宜广泛应用。应用YIDD、YVDD 特异酶切位点 PCR 技术，可准确检出血清中的 YIDD及 YVDD 变异，与测序结果完全相同，该方法成本低，适合临床用于监控抗病毒治疗。PCR 方法具有敏感性高，可检测出极微量的核酸，但不同的检测系统的敏感性即检测的最低病毒核酸量仍有差异，理论上能检出一个拷贝的基因，因
15、存在操作技术等方面的影响，其实际敏感性一般在几百个 copies/ml 左右，由于影响其测定的因数颇多，常易出现假阳性和假阴性结果，因此必须据临床上其他检（监）测资料，进行综合分析。一般 HBeAg、HBV-DNA 为病毒复制指标，HBsAg 、HbeAg、HBcAb 为病毒感染指标，当HBeAg、HBV-DNA 均为阳性时，证明病毒复制活跃，传染性强，应采取积极治疗。当 HBsAg、HBeAb、HBcAb 均为阳性，为病毒性肝炎恢复期，此时病毒复制虽不活跃，但 HBV-DNA 检测仍为阳性，说明病毒依然存在，也应采取治疗，以提高免疫抗病毒治疗为主；而当 HBV-DNA 检测为阴性时，为恢复期
16、，当各种指标证明人体内病毒已得到抑制，可以不用治疗；属于既往感染 HBV 并且现有保护性抗体 HBsAb 的确存在及 HBV-DNA 阴性时，说明已趋于好转和（或）临床治愈，可不用药。在我国感染 HBV 人群基因型中存在 B 型、C 型之分，因此感染 HBV 后不同 HBV 型与宿主作用的结果就有不同。因而 HBV-M 表达结果就有多种情况出现。而目前，还不知道能否用病毒核酸含量作为病毒滴度的替代指标，评估传播危险，血浆病毒核酸含量只能反映外周血中细胞外病毒水平，不能8反映血细胞和机体其他组织内病毒的含量。虽然较低病毒核酸含量可能提示较低滴度的暴露，但是并不能排除传播的可能，已有血浆病毒核酸含量低于检测限的病例发生母婴传播和导致正常人员职业感染的报道，职业暴露人员的免疫反应也是影响传播的因素之一。因而，分析 HBV 感染者的病情状况和病毒复制状态和病毒变异程度以及职业暴露和传播风险评估时，不能光靠 HBV-M，有必要结合HBV-DNA、HBV-M 定量同时判定。 3.3HBs
