敲除小鼠常见问题与回答

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1、敲除小鼠常见问题与回答一、什么是 ES细胞显微注射？答： 胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。 主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。 所得嵌合体小鼠的组织， 将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。 嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递， 这样可能获得转基因或打靶基因 （来源于胚胎干细胞） 稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下，大约能获得 50%继承了目的基因的后代。二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。 免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在 ,彼此能够耐受

2、 ,不产生排斥反应 ,相互间处在嵌合状态。 在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞， 使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞， 产生的个体也叫嵌合体， 即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞） 。三、条件性敲除的原理？答： Cre-LoxP系统是源于 P1 噬菌体的一个 DNA 重组体系 ,由 Cre 酶和相应的 LoxP 位点组成 ,它能导致重组发生在特定的 DNA 序列处 (LoxP 位点 ),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定 DNA 片段删除。基于 Cre-LoxP 的基因打靶要分两步来进行。首

3、先要在胚胎干细胞的基因组中引入 LoxP 序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过 Cre 介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。 Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用 Cre 重组酶表达质粒转染中靶细胞， 通过识别 LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与 Cre 转基因小鼠杂交， 筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。四、如何鉴定和挑选嵌合体？答： 动物只有部分组织细胞整合有外源基因， 则称为嵌合体动物。 它的鉴定主要根据毛色去鉴定。注射的 ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因此可以根据毛色的嵌合

4、率来鉴定和挑选嵌合体。五、 ROSA26与定点插入？答： 利用同源重组技术， 把外面的 cDNA 片段或者其他 DNA 片段， 定点插入到 ROSA26位置。ROSA26是一个安全区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。10、何谓 Flox 小鼠？所谓 Flox 小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个 LoxP 序列。这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做 Flox 小鼠。这种 Flox 小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。11、条件性敲除设计中，为什么在抗性基因的两侧设计的是 Frt-Flip 重组系统，而

5、敲除目的基因用的是 Cre-Loxp 重组系统？在设计中，其中的一个系统是为了把抗性基因去掉。另一个系统是为了把目的基因去掉。Frt-Flip 系统或 Cre-Loxp 系统都可以用来放在抗性基因或是目的基因外显子的两侧。理论上是没有区别的。只所以“在抗性基因的两侧设计的是 Frt-Flip 重组系统，而敲除目的基因用的是 Cre-Loxp重组系统” ，主要有以下几个原因：1）工具鼠： Cre-LoxP系统已经用了将近 20 年了，科学家研发了很多的 Cre 工具鼠。其实目前绝大部分工具鼠都是 Cre 工具鼠。 现在大家做一个 Flox(Flanked By LoxP)小鼠花费很多的时间和金钱

6、，都会希望自己的小鼠与更多的工具鼠交配，得到更多的结果。2) Flip 酶的活性比较低。 Flip 酶是从酵母中分离出来的。 其最适温度是 30 度， 而小鼠的体温是 37 度。 尽管现在有些实验室对 Flip 的 37 度适应性做了优化， 但应该还是没有 Cre 的活性好。把 Frt 放在抗性基因的两侧，得到小鼠之后，跟 Flip Deleter 小鼠交配，筛选出去掉了抗性基因的小鼠，就是 Flox 小鼠了。即使 Flip 的活性不高，也可以得到 Flox 小鼠。这些 Flox小鼠可以跟各种 Cre工具鼠交配，得到条件性敲除小鼠。反过来，如果用 Cre 来去掉抗性基因，得到的是 Frt 小鼠

7、。这种情况下，一是可用的工具鼠很少，二是即使有，效率也可能不高。如果看 5、 6 年前的文章， 大家其实是把 Loxp 不仅放在要敲除基因的两侧， 也用来敲除抗性基因 (NeoR)。那个时候筛选起来特别麻烦。因为要做大量的筛选，筛出只敲掉抗性基因，而没有敲掉目的基因的 Flox 小鼠。需要很多的时间和精力。12、怎样用最简单的描述区分基因敲除、基因敲进、基因敲降、和转基因 1）基因敲除（ Knockout) ：把一个基因从基因组里面全部或部分拿掉；2） 条件性基因敲除 （ Conditional KO): 把一个基因从特定细胞的基因组里面全部或部分拿掉；3）基因敲进（ Knockin)：在基因

8、组里放一个外源基因（如 GFP, LacZ, TdTomato等） ； 4）基因敲降（ Knock-down): 通过降解 mRNA 的方法降低蛋白的表达水平（一般是用 microRNA 或siRNA)。5） 转基因： 在体内过表达一个特定基因， 就象在细胞系里用高水平表达载体表达一个蛋白。13、嵌合鼠的嵌合率很高，但是得不到杂合子是什么原因？高嵌合率不代表种系传递就好。 许多实验室， 包括我们公司， 都发现特别高嵌合率的嵌合体小鼠不能交配产仔。原因不是很清楚 ,这应该跟打靶的基因是不是性染色体没有关系。可以检查一下嵌合体小鼠是不是有隐睾的现象。 另外， 毛色看到的嵌合率与生殖细胞的嵌合率不一

9、定完全一致。也有人认为雄性 ES细胞注射到雌性囊胚使得胚胎发育过程中性别转化不完全，造成的所谓不男不女现象。现在好像还没有一个定论知道到底是什么原因。14、 ROSA26位点插入外源基因的设计原理是什么？Rosa26位点基因敲入 ,在原来的设计中，目的基因 cDNA 上游带有一段转录终止序列“ Stop”（ 3 个拷贝的 SV40多聚 A 序列， tPA） ,转录终止序列的两端各有一个 Loxp 位点，将此结构定点嵌入 Rosa26 基因位置，整个结构的转录受 Rosa26 启动子控制。在没有 Cre 的情况下，由于 Rosa26启动子与目的基因之间“ STOP”的存在，目的基因不能被表达。如

10、果有 Cre 表达， Cre 重组酶将去除 “ STOP” ， Rosa26启动子就可以启动目的基因表达。 但是， 由于 Rosa26启动子是一个弱启动子，其启动能力有限，目的基因经常达不到研究人员需要的表达水平。为了解决这一问题，可以对原 Rosa26基因敲入系统做改进，引入了一个强效的启动子，如CAG 启动子 , 该启动子由鸡 actin 启动子和 CMV 增强子融合而成，用这一杂合启动子代替Rosa26启动子，从而高效地启动目的基因表达。15、在做条件性基因敲除小鼠模型的设计时，为什么不能从 exon1 敲除？条件性基因敲除小鼠模型的设计， 不能从 exon1 开始敲除， 原因是 lox

11、p site 最好不要插入到启动子区域， 因为很难预测启动子和所有调控元件的位置， loxp 的插入很有可能会因为破坏了启动子或调节原件而影响野生型蛋白的表达，所以条件性敲除设计中，一般都不会从exon1 开始敲除。16、目前基因沉默小鼠模型存在的缺陷有哪些？1） 目前用于基因沉默的技术方法主要是 siRNA。对于一个待敲除的候选基因，需要设计多个 siRNA， 并对每一个 siRNA进行验证 （一般利用细胞系） ， 这就造成筛选具有干扰作用 siRNA的选择难度相当大。2） 一般情况下， RNAi对于基因的抑制不会很完全。在体外细胞实验中，我们一般只是观察1-5 天，以验证 siRNA 的抑

12、制功能。而在小鼠体内， siRNA尽管可以降低 mRNAs 的水平，从而影响蛋白的表达，但并不一定影响基因的功能。一是蛋白表达水平虽然达不到正常水平，但可能同样发挥完整的功能； 二是蛋白表达水平降低会导致蛋白降解速度降低， 从而使蛋白的整体水平得到补偿。所以，除非非常运气， siRNA 转基因一般很难得到比较肯定的结果。如果不能完全阻断基因的表达， 利用 siRNA 进行基因敲降时沉默掉的基因仍保留一定的表达信号， 可能会得到无法解释的实验数据。 除非是为了研究 siRNA,或 miRNA 在体内的功能 （而不是研究 siRNA/miRNA 所对应的候选基因） ，一般我们不建议利用 siRNA

13、 法进行基因敲除的设计。 在这种情况下， 我们通常会建议客户做基因敲除来达到目标基因缺失其原始蛋白功能的目的。17、 为什么来源于 129 背景的小鼠胚胎干细胞的模式小鼠一定要在 C57BL/6 背景的小鼠上进行回交？1）发明小鼠基因敲除技术以来，传统上一直用 129 遗传背景的小鼠胚胎干细胞进行基因打靶制备模式小鼠， 然后在 C57BL/6 等近交系小鼠上回交 （ back-cross)超过 10 代， 才能进行诸如免疫学、 癌症、神经学等绝大部分生物医学研究。回交至少需要 2 年多的时间， 给科研工作者在时间上、 金钱上造成很大损失。 比如生物实验经常进行诸如细胞器官移植等实验， 我们从动

14、物供应商得到的小鼠多数是 C57BL/6 或 Balb/C 等纯系小鼠，而很少供应大量 129 小鼠以进行实验。 如果由 129 品系 ES细胞制备的模式小鼠在 C56BL/6品系上回交的代次不够，就会带有很多 129 小鼠抗原。 将其细胞等移植到 C57BL/6 或其他近交系小鼠后， 受体鼠会由于自身免疫排斥的原因，将转移的细胞杀死或产生耐受现象。2） 由于 129 品系小鼠遗传背景复杂， 得到的模式小鼠需在 C57BL/6 等近交系小鼠上做回交，并且回交次数不同也会造成实验结果重复性差。 这对开发制作标准模式动物是一个很大的难题，对生物科研、医药企业、安评中心、药检部门等，也是一个很大的缺

15、憾。所以如果能够直接用 C57BL/6 ES 细胞进行基因打靶， 就将直接获得 C57BL/6 品系的模式小鼠， 保证了模式小鼠的稳定性，极大的提高了制作速度缩短了科研周期。18、 既然 129 背景的模式小鼠不能直接用于多数实验科学研究， 为什么目前仍有科研机构利用 129 背景的小鼠胚胎干细胞制备模式小鼠？目前常用的 129 品系 ES细胞的优点是它们比较皮实容易操作。与其相对应能够用于基因打靶的 C57BL/6 遗传背景的 ES细胞品系目前世界上少之又少也很难得到， C57BL/6 ES cell比较娇嫩， 比如支原体污染就容易造成没有种系传递。 现今国外做 129 遗传背景模式小鼠一般

16、在35000 美元，而用 C57BL/6 ES 细胞研发模式小鼠，价格一般在 50000 80000 美元之间。但在增加科研竞争力和省去了回交时间等多方面来考虑，制备 C57BL/6 敲除小鼠还是值得的。19、 KO First 技术流程KO-First技术是通过在内含子中插入一个两边带有 FRT位点的基因破坏盒来达到敲除的目的，这个破坏盒含有 Splice acceptor (SA)(SA发挥剪接作用后， 会将基因序列剪接， 相应的片段就会被 KO，所以叫 KO First)，报告基因和 Neo。除此之外，在目的基因敲除的外显子两侧各插入两个 LoxP 位点。因此得到的小鼠是目的基因敲除同时敲入报告基因与抗 性基因的小鼠。通过灵活选择 Cre/LoxP 重组系统或者 Flp/FRT重组系统， 可达到同时获得完全性敲除和条件性敲除的实验目的。即当该小鼠与表达 Cre 的小鼠交配时，可获得目的基因敲除同时敲进报告基因的小鼠；当该小鼠与 Flp 小鼠交配时，可还原已敲除基因的表达，获得基因条件性敲除小鼠，在此基 础上 Cre 小鼠交配又可获得目的基因敲