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1、,第二节DNA复制的酶学,DNA复制的体系 底物：dNTP (dATP、dGTP 、 dCTP 、dTTP) ； 聚合酶(polymerase)：依赖DNA的DNA聚合酶， 简写为DNA-pol或DDDP； 模板(template)：解开成单链的DNA母链； 引物(primer)：提供3-OH末端的寡核苷酸； 其他的酶和蛋白质因子,一、DNA聚合酶 催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均缩写为DDDP。
2、,(一) DNA聚合酶催化的反应1. 5至3的聚合活性催化四种dNTP一个一个地接到DNA 链上去。(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,聚合反应机理：,聚合反应的特点：(1) 以单链DNA为模板(2) 以dNTP为原料(3) 引物提供3-OH(4) 聚合方向为53,2.核酸外切酶活性,35外切酶活性：切除错配的核苷酸,53外切酶活性： 切除引物 切除突变的片段,？,(二) DNA聚合酶的种类1. 原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol I:单一肽链的大分子曾被称为复制酶(replicase)含量最多可被水解成两个片段小片段(N端)：具有53外切酶活性；大片段(C端)：
3、具有聚合活性和35 外切酶活性，也称为Klenow片段，是常用的工具酶。,DNA-pol III:由10种亚基组成的不对称聚合体催化效率最高,2. 真核生物的DNA聚合酶DNA-pol 复制中延长随从链DNA-pol 没有其他pol时才起作用DNA-pol 催化线粒体DNA的复制DNA-pol 复制中延长领头链DNA-pol 校读、修复和填补缺口,(三) 复制的保真性(fidelity)至少依赖三种机制：1. 遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；3. 复制中的即时校读功能。,二、解旋解链酶类解开并理顺DNA双链，维持DNA 处于单链状态。主要有解螺旋酶、 DNA拓
4、扑异构酶和单链DNA结合蛋白。,(一) 解螺旋酶 (helicase) : 模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋 白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供 能，解开DNA双链。,复制相关蛋白的基因：dna A、dna B、dna C dna X相应的表达产物蛋白质：Dna A、Dna B、Dna C Dna X Dna A：辨认复制起始位点 Dna B：解螺旋酶 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上结 合并打开双链。,(二) 单链DNA结合蛋白 (SSB) :SSB曾被称为螺旋反稳
5、定蛋白（HDP）。在大肠杆菌，它是由177个氨基酸残基组成的 同四聚体，结合单链DNA的跨度约32个核苷 酸单位。SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制 中维持模板处于单链状态。,(三) DNA拓扑异构酶 (topoisomerase) : 拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。拓扑异构酶：是一类可改变DNA拓扑性质的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解链。,拓扑异构酶I（topo I）: 在原核生物曾被称为蛋白。 主要作用是切开DNA双链中的一股，使 DNA解链旋转中不打结，DNA变为
6、松弛 状态再封闭切口。,拓扑异构酶II（ topo II）: 在原核生物又叫旋转酶(gyrase)。能切断DNA双链，使螺旋松弛。在ATP参 与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接 断端。,三、引物酶和引发体引物酶 (primase):依赖DNA的RNA聚合酶。 催化RNA引物的合成。 在大肠杆菌，引物酶是dna G基因的产物。RNA引物：在DNA模板的复制起始部位由引物酶催 化NTP的聚合，形成短片段的RNA，为DNA 聚合提供3-OH末端。,引发体 (primosome): 是由Dna B、Dna A、Dna C以及其他复制 因子一起形成复合体，再结合引物酶形成 较大的聚合体，结合到模板DNA上。 复制开始时，在引发体的下游解开双链， 再由引物酶催化引物的合成。,四、DNA连接酶（DNA ligase） 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反应需要ATP。,ATP,DNA连接酶在复制、DNA修复、 重组、剪接中均起缝合缺口作用。 是重要的工具酶之一。,
