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1、第五章诊断酶学本章考点：1.血清酶（1）分类、生理变异与病理生理机制（2）酶活性与酶质量测定方法及其评价（3）同工酶及其亚型测定的临床意义2.血清酶活性检测技术（1）酶活性概念和表示方法（2）酶活性测定方法分类、原理、优缺点及应用（3）影响酶作用的因素（4）工具酶的概念、代谢物测定中常用的指示反应3.常用血清酶及同工酶测定的参考值及临床意义（1）肌酸激酶及同工酶和其亚型（2）乳酸脱氢酶及同工酶（3）氨基转移酶及同工酶（4）碱性磷酸酶及同工酶（5）谷氨酰基转移酶及同工酶（6）淀粉酶及同工酶（7）酸性磷酸酶及同工酶4.代谢物酶法测定第一节血清酶 一、血清酶的分类根据酶的来源及其在血清中发挥催化功能
2、的情况，可将血清酶分为两大类。（一）血浆特异酶在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试验的一部分。血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。 （有少部分酶在细胞合成后分泌到血液中行使其功能，如凝血因子及有关的纤溶因子。它们以酶原状态分泌人血，在一定的条件下被激活，引起相应的生理或病理变化。）（二）非血浆特异酶在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。1.分泌酶：来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如 -淀粉酶（AMY）、前列腺酸性磷酸酶（ACP）、脂肪酶（
3、LPS）、胃蛋白酶原、胰蛋白酶原 、ALP 等。正常体液中外分泌酶活性低而稳定，不发生催化作用。在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。2.代谢酶：（细胞酶）在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。细胞内、外浓度差异悬殊。当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血浆，导致血浆酶活性显著增高。其下降的临床意义很少。 这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都可能出现变化。二、血清酶生理变异及其病理生理机
4、制（一）血清酶生理变异除病理因素外，有不少生理因素可以影响血清酶测定数值，这些变化无临床病理意义。1.性别：大多数酶无性别差异，只有少数酶如 CK 和 GGT 存在明显差异，CK 和 GGT 都是男性高于女性，因此不能以一个参考值作为判断标准。2.年龄：不少酶在儿童期和成人时活性不同，例如新生儿的 CK 和 LD 活性常为成人的 23 倍，以后逐渐降低，到一定年龄和成人一样。变化最明显的酶是和骨的生长发育有密切关系的碱性磷酸酶。有些酶在进入老年期也可能有变化，如 ALP 和 GGT 到老年时可能有轻度升高。3.进食：多数酶不受进食影响，但酗酒可引起 GGT 明显升高。4.运动：剧烈运动可引起血
5、清中多种酶升高，升高程度和运动量、运动时间以及是否经常运动有关。升高的酶多为肌肉中含量丰富的酶，如 CK、LD、AST 等。5.妊娠与分娩：妊娠时有许多生理变化，也可出现一些酶升高，如妊娠时 ALP（因有胎盘 ALP 同工酶）升高，分娩时可能有 CK、CK-BB、LD 升高。（二）血清酶病理改变机制疾病时，影响血清酶的因素很多，主要机制如下：1.酶合成异常：血浆特异酶大多数是在肝合成，当肝功能障碍时酶浓度常下降。如血清胆碱酯酶活性在有肝功能障碍时可下降。由于酶基因变异也可引起特定酶减少或消失，如肝-豆状核综合征患者血中铜氧化酶活性可明显下降。如有骨细胞增生时，血中 ALP 可上升。此外恶性肿瘤
6、，应用某些药物，也可引起相应的血清酶变化。2.细胞酶的释放：是疾病时大多数血清酶增高的主要机制，影响细胞酶释放的主要原因有：（1）细胞内、外酶浓度的差异：非血浆特异酶在细胞内、外浓度可差千倍以上，只要有少量细胞受损伤，酶从细胞中释出，就可使血液中酶明显升高；（2）酶在细胞内的定位和存在的形式：胞质中游离的酶如 ALT、LD 最容易释放人血，而在亚细胞结构中的酶则较难释放出来，特别是线粒体酶，如肝细胞中的 AST 常需细胞出现坏死病变时才能释放人血；（3）酶蛋白分子量的大小：酶释放的速度大约和分子量成反比，此因素对酶在血液出现时间的影响大于对酶浓度高低的影响，例如 LD 分子量大于 CK，而当有
7、心肌梗死时，LD 在血液中升高的时间就晚于 CK。3.酶在细胞外间隙的分布和运送：细胞中酶有三种途径进入血液：血管内皮细胞和血细胞的酶直接进入血液；酶可同时进入血液和组织间隙，后者再入血；酶大部分进入组织间隙后再入血。这些因素都会影响酶进入血液的时间和升高的程度。4.血液中酶的清除：不同疾病和不同的酶从血液中清除的时间和机制不同，同一疾病不同酶恢复正常的时间也不一样，这和酶的半寿期以及一些其他因素有关。习题 1.下列哪种酶是血浆特异酶A.胆碱酯酶B.脂肪酶C.转氨酶D.乳酸脱氢酶E.淀粉酶正确答案A习题 2.细胞酶的释放量不受下列哪个因素的影响A.各种酶的测定波长及反应速率B.细胞内外酶浓度的
8、差异 C.酶的相对分子量D.酶的组织分布E.酶在细胞内的定位和存在形式正确答案A第二节血清酶活性检测技术 一、酶活性测定的基本知识酶测定包括酶量测定和酶活性测定。酶在体液中含量极微，仅为 ng/L 水平，测定酶量十分困难。因此临床上大都采用酶活性测定，以酶活性间接表示酶量。（一）酶活性的概念与表示法1.概念：酶活性指酶催化反应的能力即酶促反应速度。反应速度是指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。 2.表示方法：酶活性的大小通常以酶单位数表示。（1）酶的国际单位在实验规定的条件下（温度、最适 pH、最适底物浓度时），在 1 分钟内催化 1mol 底物发生反应所需的酶量为 1 个酶活
9、力国际单位（U）。（2）Katal（催量）：即每秒钟转化 1 个摩尔底物（mol /s）的酶量。国际单位和 katal 间换算关系如下：1U1mol / min 110 -6 / 60s 16.67nkatal（二）酶活性单位的计算计算酶活性单位之前，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，然后进行计算：酶单位/升=如果采用分光光度法，并知产物或底物的摩尔吸光系数，可变换为： 为摩尔（线性）吸光体系（Lmol -1cm-1）A 为吸光度变化v 为标本体积（ml）V 为反应体系体积（ml）L 为管径（cm）在实际测定中后面几项皆为常数，用 K 表示，叫做酶活力浓度测定转化因子：常数 K 值设
10、置：在测酶时，常数 K 值的选择是很重要的。比值过高虽然测定的线性范围较宽，但重复性差，反之，虽然精密度好，但线性窄。K 值设置的出发点应是测定酶的判断值或参考值上限，应保证这些值测定的可靠，所以转氨酶的常数K 一般在 3000 左右。（三）酶促反应进程能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。 酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。习题 3.酶单位 Katal 的含义是A.每秒钟能催化 1mol 底物的酶量为 1KatalB.每分钟能催化 1mol 底物的酶量为 1KatalC.每秒钟能催化 1 个单位的底物的酶量为 1KatalD.每分
11、钟能催化 1 个单位的底物的酶量为 1KatalE.每秒钟能催化 1 mol 底物的酶量为 1Katal正确答案E二、标本采集要点在实验室测定酶之前，标本要经过采集、分离血清和储存等一系列处理过程，而酶在血中是处于一个动态变化过程，血液离开体内后，会有一定变化。因此在其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值变化。1.不能溶血：因大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多。如 LDH 高 150 倍，ALT 高 7 倍。2.及时分离血细胞：防止血细胞内酶大量进入血浆； 3.及时测定：防止酶蛋白变性；4.尽量用血清标本：防止某些抗凝剂对酶的抑制作用；（除非测定与凝血或纤溶有关的酶）5.有些标本不
12、能冷冻：有的酶在低温下不稳定。常用酶如 ALT、AST、ALP、CK、GGT、和 AMY，冷冻保存在 10 个月活性变化不大。但有些酶如 LD 在融冻时被破坏，LD 在低温反而不如室温稳定，即所谓的“冷变性”。采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清，所以采血后 12小时实验室必须及时离心，分离血清。一般都不采用血浆而采用血清作为测定标本。大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性。酶蛋白不稳定，易失活。大部分酶在低温中比较稳定，分离血清如不能及时测定，应放冰箱保存。三、酶的测定（一）酶活性测定方法1.按反应时间分类法：20 世纪 50 年代以前大都使用固定时间法。这种
13、方法是以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。50 年代中期开始采用连续监测法。这种方法用自动生化分析仪上完成，可以测酶反应的初速度，其结果远比固定时间法准确，在高浓度标本尤为明显，但本法也受到反应时间，反应温度，试剂等的影响，应加以注意。（1）定时法：（两点法）通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1 到 t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。其中 t1 往往取反应开始的时间。酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止（也叫中止反应法）。加入试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。该法最基本的一点是停止反应后才测定底物
14、或物的变化。优点：简单易行，对试剂要求不高。缺点：难保证测定结果的真实性。难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。随着保温时间的延续，酶变性失活加速。 （2）连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。连续监测法根据连续测得的数据，可选择线性期的底物或产物变化速率用于计算酶活力。 因此连续监测法测定酶活性比定时法更准确。实际工作中，采用工具酶的酶耦联法已经成为应用最广、最频繁测酶活性浓度的方法。（3）平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终
15、点法。2.按检测方法分类法：分光光度法；旋光法；荧光法；电化学方法；化学反应法；核素测定法；量热法。（二）酶质量测定法利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位 ngml、gL 来表示酶含量的高低。免疫学方法与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。如肌酸激酶同工酶 MB（CKMB）质量测定较活性测定对疾病的诊断价值高。四、酶活力测定的影响因素（酶反应动力学）大多数酶促反应是可逆反应，酶反应动力学中所
16、指速度是反应的初速度。影响酶活性的因素包括底物的浓度、酶反应的最适 pH、最适温度、酶的抑制作用，另外还包括试剂中表面活性剂的作用等因素。（一）底物浓度的影响：在检测试剂中底物浓度、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度均对酶的测定至关重要。其中以底物的种类和浓度最为重要。底物浓度的影响不是简单的直线关系，米氏方程描述了底物浓度对酶促反应速度的影响。1.米氏方程： 当S m当底物浓度足够大，反应速度不再受底物浓度影响，反应速度达到最大反应速度，是零极反应。所以检测酶活性时，要保证有足够的底物浓度。2.Km： Km 值为反应速度相当于最大反应速度一半时的底物浓度。Km 值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。Km 反映酶与底物的亲合力 Km 值越大，酶与底物亲合力越小，反应速度越慢。底物浓度的影响主要是两个方面即底物的种类和浓度，两者都与 Km 有关。（1）如果所测的酶专一性不强，可作用于多种底物，K
