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1、实验一、 酸性磷酸酯酶的提取分离纯化一、目的掌握胞内酶的分离提取方法，学会离心机的使用。二、原理酸性磷酸酯酶 (Acid Phosphatase ， E C 3 1 3 2) 存在于植物的种籽、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中， 能专一性地水解磷酸单酯键。 本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：由上式可见， 当有足量的底物磷酸苯二钠存在时， 酸性磷酸酯酶的活力越大， 所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成 1微摩尔 ( mo1)产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用
2、 Folin 一酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。本实验采用的是 Folin- 酚法。实验前将绿豆芽细胞破碎， 释放出酸性磷酸酯酶， 离心除去细胞碎片和植物纤维等杂质，得到酸性磷酸酯酶的粗酶溶液，为下面的酶学性质研究及 SDS-PAGE电泳法测分子量等系列生物化学实验做准备。三、实验器材1 LGl0 2.4A 高速离心机：北京医用离心机厂生产， 1 台组2 托盘天平： 1 台组。3 滴管： 1 支组。4 100 mL 烧杯： 2 只组。5 100mL三角烧瓶： 1 只组。6 漏斗： 1 只组。7 纱布：若干。8 滤纸：若干。9 碾钵： 1 套组。10 培养皿： 1 个
3、组。11 100mL量筒： 1 支组。12 塑料手套：多双组。13 记号笔：公用。14 绿豆芽：当日采摘， 50 克组。15.SephadexG-150 均为 pharmaeia 产品。四、实验试剂1.0.01mol/LHAc 一 NaAc缓冲液：2.0.2mol/LNaOH 溶液3.5.5mmol/LPNPP （ 对硝基苯磷酸二钠）五、操作1匀浆：戴上手套，将绿豆芽掐去根和叶得绿豆芽茎，称取 50 g 的绿豆芽茎，在碾钵中用碾锤彻底捣碎，室温静置 0.5 h ，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。2平衡：将 2 只 100mL烧杯分别放到托盘天平的 2 只托盘上进行平衡。将滤液倒人 2 支离
4、心管中， 再把离心管连同其盖子分别放入托盘上的 2 只烧杯中， 用滴管增、 减离心管中的溶液使其在托盘天平上进行平衡，平衡后盖上离心管的盖子，用记号笔做好标记。3 离心： 4 000 r min 离心 20 min 。4 保存： 将离心管中大部分上清液倒人量筒中， 少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后倒入三角烧瓶中做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”在冰箱中保存备用。5、 将原酶液精确等分， 一部分在冰箱中保存备用。 另一部分用于实验六的 sephadexG-150柱层析。6. 酶活力的测定将 pNPP溶于 0.1mmol/LHAc-NaAc 缓冲液中配成 5
5、.5mmol/L 底物溶液，每 lmL 底物溶液加入 0.2mL 酶液， 37oC保温 1 小时， 再加入 4mL0.2mol/LNaOH 溶液终止反应， 混匀后测 405nm光吸收值。 以先在底物溶液中加入 4mL0.2mol/LNaOH溶液后再加入 0.2mL 酶液作对照。 在此条件下，以每小时催化释放 1umol 对硝基苯酚的酶量定义为 1 个活力单位。五、计算上清液体积（ mL） 粗酶液得率（ mL） =上清液体积绿豆芽茎质量 100% 六、注意事项1 使用离心机前必须将离心管 ( 连同其盖子 )精确平衡。2 离心过程中，若听到异常响声，可能是出现了离心管破碎或离心管不平衡等情况，应立
6、即切断电源，停止离心，检查原因3 在离心机高速运转过程中切勿打开离心机盖，以防造成意外事故。4 避免离心机连续使用时间过长，一般使用 60 min 后要隔 2030 min 再使用。5 有机溶剂会腐蚀离心管，酸、碱、盐溶液会腐蚀金属，若发现渗漏现象应及时擦洗干净以免损坏离心机。思考题1 实验操作过程中为什么需戴上手套？2 豆芽在碾钵中用碾锤彻底捣碎对酶液提取起到什么作用 ? 3 离心管中的沉淀物可能是哪些成分？实验二、 酶促反应进程曲线的制作一、目的学会制作酶促反应的进程曲线，掌握可见分光光度计的使用。二、原理要进行酶的活力测定， 首先要确定酶的反应时间。 酶的反应时间并不是任意规定的， 应该
7、在初速度范围内进行选择。 要求出代表酶促反应初速度的时间范围就必须制作酶促反应的进程曲线。所谓进程曲线是指酶促反应时间与产物生成量 ( 或底物减少量 ) 之间的关系曲线。它表明了酶促反应随反应时间变化的情况。 本实验的进程曲线是在酶促反应的最适条件下采用每间隔一定的时间测定产物生成量的方法， 以酶促反应时间为横坐标， 产物生成量为纵坐标绘制而成的。 从进程曲线可以看出， 曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线， 其斜率代表酶促反应的初速度。但是，随着反应时问的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低。 反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高使逆反应
8、加强等原因所致。 因此， 要真实反映出酶活力的大小， 就应该在产物生成量与酶促反应时间成正比的这一段时间内进行测定。 换言之， 测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。 制作进程曲线， 求出酶促反应初速度的时间范围是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。三、实验器材1 VIS-7220 型可见分光光度计2 HH一 2 型数显恒温水浴锅3 取样器：请参见实验一， 5 mL、 1mL。各 1 支组。4 试管： 20 支组。5 试管架： 1 个组。四、实验试剂1 酸性磷酸酯酶酶液：取原酶液用 0.2 mol L 的 pH5 6 乙酸盐缓冲液稀释 10 20倍。2 5 mmol L 磷酸苯二
9、钠溶液 (pH5.6) ：精确称取磷酸苯二钠 (C6H6Na2PO4 2H2O，相对分子质量 254.10)2.54 g ，加蒸馏水溶解后定容至 100mL，即配成了 100 mmol L 磷酸苯二钠水溶液，密闭保存备用。用 0.2mol L 的 pH5.6 的乙酸盐缓冲液稀释 20 倍，即得 5mmol L磷酸苯二钠溶液 (pH5.6) 。3 0.2 mol L 的 pH5.6 乙酸盐缓冲液。4 Folin- 酚试剂：于 2 000 mL 磨口回流装置内加入钨酸钠 (Na 2WO4 2H2O)100 g ，钼酸钠 (Na 2MoO4 2H 2O)25 g ，水 700 mL， 85磷酸 50
10、 mL，浓盐酸 100 mL。微火回流 10 h 后加入硫酸锂 150 g ，蒸馏水 50 mL 和溴数滴摇匀。煮沸约 15min，以驱逐残溴，溶液呈黄色，轻微带绿色；如仍呈绿色，须重复滴加液体溴的步骤。冷却后定容到 1000mL，过滤，置于棕色瓶中可长期保存，使用前，用蒸馏水稀释 3 倍。5 1 mol L 碳酸钠溶液。6 0.4 mmol L 酚标准应用液：精确称取分析纯的酚结晶 0.94g 溶于 0.1mol L 的 HCl溶液中，定容至 1 000mL，即为酚标准贮存液，贮存于冰箱可永久保存，此时的酚浓度约为0.01mol L。使用前将上述的酚标准贮存液用蒸馏水稀释 25 倍，即得到
11、0.4 mmol L 酚标准应用液。五、操作检查试管是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内 120烘干。1加样与酶促反应：取试管 12 支，按 0 到 11 的顺序逐管编号，空白为 0 号。各管加0.5mL 5mmol L 磷酸苯二钠溶液，在 35恒温水浴锅中预热 2min 后，在 1 11 管内各加入0.5 mL预热的酶液。酶液一加入立即精确计时井摇匀，按时间 3、 5、 7、 10、 12、 1 5、 20、25、 30、 40 和 50min 在 35恒温下进行定时酶促反应 ( 酶液加入时为起始时间， 碳酸钠溶液加人时为终止时间 )， 参见图 8 2 一 4。 当酶促反应进行到上述
12、相应的时间时， 加入 1 mol/L碳酸钠溶液 5mL终止反应，时间控制详见表。管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 酶液加入时刻（ min 11 号试管最先加样）10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 碳酸钠加入时刻（ min）13 14 15 17 18 20 24 28 32 41 50 2 显色： 加完 1 mol L 碳酸钠溶液 5 rnL 后再向试管中加入 0.5mL Folin 一酚稀溶液，混匀，保温约 10 min 即可显色。空白管所加试剂相同，但酶液最后加入。3 测定：冷却后以 0 号管作空白，在可见光分光光度计上 680 nnl 波长处测定各管的吸光度
13、 A680。酶促反应操作安排管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 5mmol/L 磷酸苯二钠溶液 各 0.5ml 酶液（ 35预热过的） 各 0.5ml， 一加入就计时， 注意合理安排各管的加入时间，最好先加第 11 管，隔 1min 再加第 10 管（详见表 8-2-1）0 35精确反应时间（ min） 3 5 7 10 12 15 20 25 30 40 50 1mol/L 碳酸钠溶液 各 5mL （用于终止反应）Folin- 酚稀溶液 各 0.5mL 0 号试管加入酶液 0.5mL 35保温显色 10min 以上A 680 0 4 画图：以反应时间为横坐标， A680
14、 为纵坐标绘制进程曲线，并将其贴在实验报告上，由进程曲线求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围 ( 直线部分涵盖的时间 )。5 清洁：将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计 ( 尤其是比色槽内 ) 、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。六、计算试管 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A680 初速度的时间范围： 0 min 七、注意事项1 酶促反应应保持温和条件，反应液要避免剧烈搅拌或震荡。2 实验前要设计好每支试管的加样顺序，确保反应时间的准确性。3 酶促反应的加样顺序不得搞错，否则无法显色。思考题1 随着反应
15、时间的延长， 曲线的斜率不断下降， 说明反应速度逐渐降低， 这是为什么？2 如果酶促反应在一个较大的体系中，如在烧杯中进行，每隔一定的时间从烧杯中取样测定该体系中产物的生成量， 并绘制酶促反应进程曲线， 该方法和本书采用的方法结果会一致吗 ?哪个更好一些？实验三、 酸性磷酸酯酶的酶活力测定一、目的通过对酶促反应速度的测定，计算出酶的活力，掌握可见分光光度计的使用。二、原理请参见实验一三、实验器材请参见实验二四、实验试剂请参见实验二五、操作检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内 120烘干。1 标准曲线的制作取试管 6 支，按 0 到 5 的顺序逐管编号，空白为 0 号。按照表
16、8 3 1，向各试管中依次加入 0.4mmol L 酚标准应用液、 0.2 mol L 的 pH5.6 的乙酸盐缓冲液、 1 mol L 碳酸钠溶液和 Folin 一酚试剂，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。摇匀，在 35保温 10min以上 ( 先用烧杯盛 35的水，置于水浴锅中，再将试管放人烧杯中保温，以防试管滑落人水中 ) ，参见实验八 (2) 的图 8 2 4。以 0 号试管为空白，在可见光分光光度计上 680 nm波长处读取各管的吸光度 A680，以 A680 为横坐标、酚标准应用液的毫升数为纵坐标作一条标准曲线，它应该是一条直线。保留该数据，以便实验八 (4) 直接引用。以上操作总结为表标准曲线的制作试管 1 2 3 4 5 0 0.4mmol/L 酚标准
