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1、发酵工艺控制,内容：第一节、发酵过程中的主要控制参数第二节、发酵过程中的代谢变化第三节、菌体浓度影响及其控制第四节、基质的影响及其控制第五节、温度的影响及其控制第六节、pH的影响及其控制第七节、溶氧的影响及其控制第八节、二氧化碳的影响及其控制第九节、补料的作用和控制第十节、泡沫的影响及其控制第十一节、发酵终点的判断,了解发酵工艺过程控制的重要性,发酵是一种很复杂的生化过程，其好坏涉及诸多因素。除了菌种的生产性能，还与培养基的配比、原料的质量、灭菌条件、种子的质量、发酵条件、过程控制等有密切的关系。由于高产菌种对工艺条件的波动比低产菌种更敏感，通常菌种的生产性能越高，其生产条件越难满足。发酵生产
2、受许多因素的影响和工艺条件的制约，故掌握生产菌种的代谢规律和发酵调控的基本知识对生产的稳定和提高具有重要的意义。,第一节、发酵过程中的主要控制参数,本节内容: 一、物理参数二、化学参数三、生物参数,参数可以反映发酵工艺的变化,影响发酵的因素太多。有些因素还是未知的，且其主要影响因素也会变化。因此了解发酵工艺条件对发酵过程的影响和掌握反映菌的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。与微生物发酵有关的参数，可分为物理、化学和生物三类。,参数控制流程,常用工业发酵仪器,一、物理参数,温度（）压力（Pa）搅拌转速(r/min)搅拌功率（kW） 空气流量（V/(Vmin)
3、）粘度（Pas 或kg.s/m2）浊度（）料液流量（Lmin）,二、化学参数,1pH（酸碱度）2基质浓度（g或mg）3溶解氧浓度（ppm或饱和度，）4氧化还原电位（mV）5产物的浓度（g（u）ml）6. 废气中的氧浓度（Pa）7. 废气中的CO2浓度（）细胞生物活性的其它化学参数：如NADNADH体系、ATPADPAMP体系、DNA、RNA、生物合成的关键酶等,三、生物参数,1菌丝形态 丝状菌发酵过程中菌丝形态的改变是生化代谢变化的反映。一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。2菌体浓度 菌体浓度的大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响。
4、在生产上，常常根据菌体浓度来决定适合的补料量和供氧量，以保证生产达到预期的水平。,第二节、发酵过程中的代谢变化,本节内容:一、分批发酵二、补料分批发酵三、半连续（发酵液带放）四、连续发酵,一. 分批发酵,1. 分批发酵的基础理论分批发酵的物料平衡微分方程：,X为菌体浓度 g/Lt为培养时间 h 为比生长速率 h-1 S为基质浓度 g/Lqs为比基质消耗速率 g/（g.h)p为产物浓度 g/Lqp为比产物形成速率 g/(g.h),分批发酵过程一般可粗分为四期，即适应（停滞）期、对数生长期、生长稳定期和死亡期,比生长速度,式中X0为菌的初始浓度；Xt为经过培养时间t的菌度。将菌体浓度的自然对数与时
5、间作图可得一直线，其斜率为，即比生长速率。,生长关联型和非生长关联型,(1). 生长关联型 根据产物的形成是否与菌体生长同步关联，将产物形成动力学分为生长关联型和非生长关联型。一般，初级代谢产物的形成与生长关联；而次级代谢产物的形成与生长无关。(2). 非生长关联型 此类型的产物形成只与细胞的积累量有关，而与产物形成速率与菌的生长速率无关。次级代谢产物中的一些抗生素的产物合成即属于这一类。,杀假丝菌素分批发酵中的葡萄糖耗，DNA含量和杀假丝菌素合成的变化,2. 分批发酵的重要生长参数,A B XY（S0St）S0为初始基质浓度，gLSt为经培养时间t的基质浓度Y为得率系数，g细胞/g基质,C
6、D maxS/(KSS)max是最大比生长速率，h-1；KS为基质利用常数，相当于max2时的基质浓度，gL,3. 分批发酵的优缺点,优点： 即操作简单，周期短，染菌的机会减少和生产过程、产品质量易掌握。 缺点： 存在基质抑制问题，出现二次生长（diauxic growth）现象。如对基质浓度敏感的产物，或次级代谢物，抗生素，用分批发酵不合适，因其周期较短，一般在12天，产率较低。,二. 补料(流加)-分批(fed-batch)发酵,1. 补料-分批发酵的理论基础 由于只有料液的输入，没有输出，因此，发酵液的体积在增加。若分批培养中的细胞生长受一种基质浓度的限制，则在任一时间的菌浓可用式表示：
7、 XtX0+Y（S0St） 在St接近S0时补料，输入的基质等于细胞消耗的基质。故dSdt0，虽培养液中的总菌置XT随时间的延长而增加，但细胞浓度Xt并未提高，即dXdt0，这种情况称为准稳态。随时间的延长，稀释速率将随体积的增加而减少。,2. 分批补料的优点,与传统的分批发酵相比，优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。低基质浓度的优点：（1）可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；（2）克服养分的不足，避免发酵过早结束。,三、 半连续发酵,在补料-分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液（行业中称为带放）便可称为半连续发酵。带放是指放掉的发酵液和其他正常
8、放罐的发酵液一起送去提炼工段。放掉部分发酵液，再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。,半连续发酵的优点,（1）可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的盾。（2）克服养分的不足，避免发酵过早结束。（3）缓解有害代谢产物的积累,半连续发酵的不足,放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体；定期补充和带放使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体积更大；发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终限制发酵产物的合成；一些经代谢产生的前体可能丢失；有利于非产生菌突变株的生长。,四、 连续发酵,连续培养是发酵过程中一边补入新
9、鲜的料液，一边以相近的流速放料，维持发酵液原来的体积。1、 单级连续发酵的理论基础 可用D来表示其稀释速率（h-1）： D=FV F为料液流速，Lh V为发酵液的体积，L 在一定时间内细胞浓度的净变化dXdt为： dXdtXDX X为生长速率，g（Lh） DX为细胞排放速率，g（Lh）,在稳态条件下dXdt,dXdt0，即XDX，故D，即在稳态条件下可通过补料速率来控制比生长速率，因V不变。以max S/（Ks+S）代入 dXdtXDX 得： dX/dt(maxS)/（Ks+S）DX KS为基质利用常数，相当于max2时的基质浓度，gL,在稳态条件下残留基质浓度的净变化dSdt,dSdt基质的
10、输入-基质的输出-细胞的消耗 dS/dtDS0一DS一XmaxS/Y(Ks+S) 在稳态下，dX/dtdS/dt0 SKsD/(maxD)Y为得率系数，g细胞/g基质KS为基质利用常数，相当于max2时的基质浓度，gL X和S分别为稳态细胞浓度和稳态残留基质浓度,式SKsD/(maxD)解释了D如何控制。,细胞生长将导致基质浓度下降，直到残留基质浓度等于能维持D的基质浓度。如基质浓度消耗到低于能支持相关生长速率的水平，细胞的丢失速率将大于生成的速率，这样S将会提高，导致生长速率的增加，平衡又恢复。,2、 多级连续培养,基本恒化器的改进有多种方法，但最普通的办法是增加罐的级数和将菌体送回罐内。,
11、恒化器,连续培养浓缩菌体两种办法：,限制菌体从恒化器中排出，让流出的菌体浓度比罐内的小；将流出的发酵液送到菌体分离设备中，如让其沉积或将其离心，再将部分浓缩的菌体送回罐内。部分菌体返回罐内的净效应为：罐内的菌体浓度增加了；这导致残留基质浓度比简单恒化器小；菌体和产物的最大产量增加；临界稀释速率也提高。菌体反馈恒化器能提高基质的利用率，可以改进料液浓度不同的系统的稳定性，适用于被处理的料液较稀的品种，如酿造和废液处理。,3、 连续培养的优缺点,连续培养有以下优点：（1）维持低基质浓度：可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；（2）避免培养基积累有毒代谢物；（
12、3）可以提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间；（4）便于自动控制。,连续培养也有缺点：,（1）长时间的连续培养难以保证纯种培养；（2）菌种发生变异的可能性较大,第三节、菌体浓度影响及其控制,本节内容:一、影响菌生长速率的因素二、菌浓度对发酵产物得率的影响三、菌浓度的控制,菌体（细胞）浓度,菌体（细胞）浓度（简称菌浓，cell concentration）是指单位体积培养液中菌体的含量。,一、影响菌生长速率的因素,1、 菌浓的大小与菌体生长速率有密切关系。 典型的细菌、酵母、霉菌和原生动物的倍增时间分别为45分钟、90分钟、3小时和6小时左右。2、菌体的增长与营养物质和环境条件
13、有密切关系,二、菌浓度对发酵产物得率的影响,发酵产物的产率与菌体浓度成正比关 系菌浓过高则会产生不利的影响 摄氧速率与传氧速率相平衡时的菌体浓度，是临界菌体浓度,三、菌浓度的控制,控制菌浓的方法： 菌体的生长速率，在一定的培养条件下，主要受营养基质浓度的影响，所以要依靠调节培养基的浓度来控制菌浓。1、首先要确定基础培养基配方中有个适当的配比，以避免产生过浓（或过稀）的菌体量2、然后通过中间补料来控制，如当菌体生长缓慢、菌浓太稀时，则可补加一部分磷酸盐，促进生长，提高菌浓；但补加过多，则会使菌体过分生长，超过临界浓度，对产物合成产生抑制作用。3、利用菌体代谢产生的CO2量来控制生产过程的补糖量，
14、以控制菌体的生长和浓度,第四节、基质的影响及其控制,本节内容:一、碳源的种类和浓度影响和控制二、氮源的种类和浓度影响和控制三、磷酸盐浓度的影响和控制,基质的影响及其控制,基质是产生菌代谢的物质基础，既涉及菌体的生长繁殖，又涉及代谢产物的形成。 它们及其代谢产物又是许多调节控制机制的效应剂，也影响产物的形成。,一、碳源的种类和浓度影响和控制,1）、迅速利用的碳源：葡萄糖、蔗糖等。迅速参与代谢、合成菌体和产生能量，并产生分解产物，有利于菌体生长，但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用 。,2）、缓慢利用的碳源,缓慢利用的碳源：多数为聚合物、淀粉等。为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，
15、特别有利于延长抗生素的分泌期，也有许多微生物药物的发酵所采用。在工业上，发酵培养基中常采用含迅速和缓慢利用的混合碳源,二、氮源的种类和浓度影响和控制,（1）迅速利用的氮源：氨基（或铵）态氮的氨基酸（或硫酸铵等）、玉米浆容易被菌体利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成特别是某些抗生素的合成产生调节作用，影响产量,2）缓慢利用的氮源,延长代谢产物的分泌期、提高产物的产量；但一次投入也容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体过早衰老而自溶，缩短产物的分泌期。发酵培养基一般选用含有快速和慢速利用的混合氮源，还要在发酵过程中补加氮源来控制浓度。补加有机氮源，如酵母汁、玉米浆、尿素；补加无机氮源，如氨
16、水或硫酸铵。,三、磷酸盐浓度的影响和控制,菌体生长所允许的浓度比次级代谢产物合成所允许的浓度就大得多。对于初级代谢来说，要求不如次级代谢那样严格。对抗生素发酵来说，常常是采用生长亚适量(对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量)的磷酸盐浓度,总的来说，培养基过于丰富，会使菌生长过盛，发酵液非常黏稠，传质状况很差。细胞不得不花费许多能量来维持其生存环境，即用于非生产的能量倍增，对产物的合成不利。除上述主要基质外，还有其它培养基成分影响发酵。如Cu2+，在以醋酸为碳源的培养基中，能促进谷氨酸产量的提高，Mn2+对芽孢杆菌合成杆菌肽等次级代谢产物具有特殊的作用，必须使用足够的浓度才能促进它们的合成等。有关前体物质浓度的控制放在各论中进行讨论。,
