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1、第四章 有机酸和维生素的分析第一节 概述,果实具有酸味，是因为含有各种有机酸，其中以柠檬酸、苹果酸、酒石酸为主，这三种酸通称为果酸，此外，还有草酸、水杨酸及少量的挥发性蚁酸、醋酸、丁酸，这些挥发酸含量虽少，但它们的酯类则是重要的芳香物质，给予果实特有香气。,一定的酸度含量能使农产品、食品具有一定的风味,质地和色泽,如：苹果中所含的苹果酸;柠檬中所含的柠檬酸等成分,它们使这些水果具有人们喜爱的酸味和酸甜味。有机酸具有防腐和抗氧化作用，但过量时又显示出不良的品质。测定果蔬的酸度及其与糖含量的比值，能判断果蔬的成熟度和品质。如：采后随着时间延长，因生理作用，其可滴定酸含量急剧下降，肉质淡而无味；低温
2、贮藏和气调贮藏能明显延缓可滴定酸的代谢消耗.,果实酸味的强弱，并非决定于酸的总含量，而是决定它的酸碱值的高低，即氢离子的离解度大小，氢离子愈多则愈酸。不过果实中含有各种缓冲物质，如蛋白质、氨基酸等成分，能起一定的缓冲作用。但当果实或果汁加热或煮熟时，由于蛋白质凝固，失去了缓冲作用，同时因温度升高，也促进酸的离解，则氢离子增加使得果实酸味增大。,由于酸的种类不同，氢离子的离解度的大小也有很大差别，如酒石酸较柠檬酸和苹果酸的酸味大。一般果实中含酸在0.10.5%时，感觉比较适口，含酸在0.51%时，便觉酸味较浓。 各种有机酸在果实组织中以游离或盐式状态存在。例如，甜橙所含柠檬酸大约有50%呈游离态
3、，40%为柠檬酸钾盐，10%为柠檬酸钙盐。,在同一种果实中，其所含的有机酸并非是单纯某一种，往往数种同时存在。但在分析测定果实中的含量时，多以果实所含的主要有机酸种类为计算标准。如柠檬酸含于柑橘类、石榴、凤梨等果实中；苹果酸主含于仁果类、核果类；酒石酸为葡萄的主要有机酸，故也称为葡萄酸.,新鲜果实及其加工品的风味，主要决定于糖分和酸分的比例（简称糖酸比）。在加工过程中，酸分的存在可以促使蔗糖的转化和果胶物质的水解，还能与金属化合而影响制品的风味和色泽。在处理高酸分的果实时，对于所用的器械、用具和仪器，最好是非金属的。 氢离子的存在对微生物的活动是非常不利的，可以降低微生物的致死温度，一般果实p
4、H值为2.5-5.0之间，加热至100后便能达到杀菌的效果。,糖和有机酸是果汁中主要的风味营养物质，其含量高低与果汁制品的品质有密切的关系。因此，糖和有机酸含量的测定是国内外果汁生产企业极为关注的问题之一。植物体内有机酸含量分析是近几年来研究的热点,尤其是在逆境生理方面，果实中有机酸种类与含量也是衡量果实品质的重要指标。,有机酸在食品的加工、贮存、品质管理、评价以及生物化学等领域，被认为是重要的成分，要求对农产品中的总酸量、特定的有机酸进行定量，以及分析全部有机酸的组成。综上所述,酸度对农产品、食品和饮料,酒类以及发酵产品有着重要的作用,并且,影响酸度的有机酸又是农产品、食物和酒中重要的呈味成
5、分,是一类重要的分析项目。,人们在味觉中的酸度，主要不取决于酸的总量，而是取决于离子状态的那一部分酸(游离酸)，一般以氢离子浓度(pH值)来表示，称为有效酸度。测定pH值的方法很多，其中以pH计较为准确、简便。各种有机酸的分离和定量。通常用柱层析法、纸层析法、气相色谱法和羧酸分析仪法。,常规的酸度分析包括总酸度(可滴定酸度)、有效酸度(氢离子活度、pH值)和挥发性酸。 总酸度即可滴定酸度,它简单，实用，总酸度是所有酸性成分的总量，通常用标准碱来测定，并以酚酞指示剂指示其滴定终点,以此进行定性、定量分析, 是一种强碱弱酸的中和滴定反应;并以样品中所含主要酸的质量分数()表示。,但有的农产品由于缓
6、冲作用和色素的影响，往往难以判断滴定终点，在这种情况下，可以使用电位滴定法。代表了样品中所含各种酸的总和,而不能全面地准确地表达农产品中所含各种酸的确切的含量。,挥发酸的分析也属于此类强碱弱酸的中和滴定，农产品中的多种有机酸可根据它们的沸点高低分为挥发性和不挥发性酸,常规的总酸测定结果中包含了挥发酸的含量，在挥发酸的分析中,通过加热样品蒸馏分离后,便可在分析中测定出农产品中所含挥发酸的含量,这种挥发酸以蚁酸计。,总酸度，挥发酸和有效酸度的pH值都是酸度的表达方式,它们之间有一定的内在联系,即都表示了被测物中酸度的大小,但是,它们在含义上却有不同之处，酸度中的总酸度的测定都是在测定过程中,被检样
7、品中的酸性成分和强碱的氢氧化钠标准液进行中和反应,定量地得出其中含酸成分的大概含量(因都以所含主要有机酸计算的),这些酸的成分不管它们的酸性强弱,氢离子离解度的大小,都同样在强碱弱酸的中和滴定中反映到测定结果中。,而有效酸度中的pH值却只表示了被测样品中氢离子浓度的大小，相同总酸度的不同样品中,由于所含的酸的种类不同,从理论上讲,它们的pH值也会有所差异。而挥发酸的测定,却比较真实地反映了样品中低沸点的蚁酸含量的多少,不能概括样品中其它多种沸点较高的有机酸的含量和样品pH值的高低。,滴定法只能测定食品的总酸度，不能具体反映出有机酸的种类和含量，所需费用较低,但影响因素较多,准确度差。比色法只能
8、测定单一的有机酸。薄层色谱法一次可测定多种有机酸,但测量精度差,可以定性,不适合定量。,气相色谱法仅适于测定其中的挥发性有机酸,常因有机酸的沸点较高，不易气化而需要先对其衍生再进行测定，方法繁琐，难以用于热稳定性差和含量极低的有机酸分析;同时又因有机反应不易定量进行而直接影响测定结果的准确性。,这些方法往往只适用于某些特殊样品或不常见有机酸的分析，而且能达到同时分离的有机酸种类较少。离子色谱法多采用稀强酸,如稀盐酸和稀硫酸作淋洗液,对设备有一定腐蚀作用。而高效液相色谱法分析有机酸可以克服上述不足之处, 并且实现一机多用,一柱多用。,在高效液相色谱法检测食品中的有机酸时，最重要的是选择最佳的色谱
9、分离条件，这些条件中涉及流动相的pH值、流速、柱温、检测波长等等。流动相配比影响着流动相的pH值，从而对柱效和峰的分离均有影响。,流速同样是影响其分离效果的一个重要因素，流速过低则分离时间过长，柱效差，而流速过高又导致峰挤在一起分不开。根据色谱理论，柱温是影响柱效和分离度的主要因素，柱温升高可以降低流动相的粘度和提高树脂的传质效率，但是太高又会破坏色谱柱，所以色谱条件的选择是相当复杂的，要综合众多的考虑因素。,总酸度的测定果品中的总酸度是指未离解和已离解的酸的总浓度，总酸度的含量随果品的生育期和贮藏的阶段不同，有着很大的变化，直接影响着果品的味道，颜色，稳定性和质量的好环，是鉴定水果品质的一项
10、最要指标、由于在维持人体的酸碱平衡方面起着显著的作用，所以，它亦直接影响着果品的营养价值，因此，果品中的总酸度是食品检测分析中常做的项目之一。,方法原理：样品中的有机酸用碱滴定时，被中和生成盐类。反应如下：注释 1本试验所用蒸馏水应经煮沸除去二氧化碳。 2若颜色过深，可先加入等量蒸馏水稀释后再滴 定或用活性炭脱色（损失较大，滴定值偏低）。终点不易辨认时，可用原样作对照，判明终点，也可改用电位或电导滴定法。,3.总酸测定的结果一般以样品中含量最多的酸来表示。一般葡萄的总酸度用酒石酸表示；柑桔以柠檬酸表示；苹果、核仁、核果、浆果和蔬菜类按苹果酸表示；牛乳、水产品以乳酸表示。4.农产品中的有机酸均为
11、弱酸，用强碱(NaOH)滴定时，其滴定终点偏碱，一般在pH8.2左右，所以，可选用酚酞作为指示剂，微红色，30s内不褪色为终点。 。,5.氢氧化钠标准溶液用基准物质来标定。常用的有草酸和邻苯二甲酸氢钾等。采用邻苯二甲酸氢钾，它与氢氧化钠的反应为： KHC8H4O4 + NaOH KNaHC8H4O4 + H2O 到达化学计量点时，溶液呈弱碱性，可用酚酞作指示剂。,标定盐酸常用的基准物质有无水碳酸钠 Na2CO3和硼砂Na2B4O710H2O。采用硼砂较易提纯，不易吸湿，性质比较稳定，而且摩尔质量很大，可以减少称量误差。硼砂与盐酸的反应为： Na2B4O710H2O + 2HCL 2NaCL +
12、 4H3BO3 + 5H2O 在化学计量点时，由于生成的硼酸是弱酸，溶液的pH值约为5，可用甲基红（4.46.2, 红黄 ）作指示剂。,挥发性酸的测定挥发性酸主要是指醋酸、蚁酸、丁酸和痕量的甲酸等霉烂的果蔬、籽粒，未成熟的种子和果实，常含有较多的挥发性酸，它的含量是农产品品质好坏的一个重要指标。,挥发性酸包括游离态和结合态两部分。前者在蒸馏时较易挥发，后者比较困难。测定挥发性酸的方法有直接法和间接法。直接法是用碱液滴定由蒸馏或其它方法所得的挥发性酸；间接法是将挥发性酸蒸发除去后，滴定残渣的不挥发酸的酸度，再由总酸度减去此残渣酸度即得挥发酸含量。一般用直接法较为方便。,方法原理 挥发酸可用水蒸气
13、分离，加入磷酸可以使结合挥发性酸离析。挥发性酸经冷凝收集后，再用标准碱滴定。,注意事项：1.蒸馏前蒸汽发生瓶中的水应先煮沸l0min，以排除其中的CO2，并用蒸汽冲洗整个蒸馏装置。 2.整套蒸馏装置的各个连接处应密封，切不可漏气。3.滴定前将馏出液加热至6065，使其终点明显，加快反应速度，缩短滴定时间，减少溶液与空气的接触，提高测定精度。,4磷酸的浓度：19，50ml加1ml。5挥发性酸的滴定须把蒸出液为300ml左右。6滴定终点，1min不褪色为终点。7.挥发性酸的结果计算以蚁酸计。蚁酸的摩尔质量为60g。,有效酸度(pH)的测定,果蔬食品的pH值的变动不仅取决于原料品种和成熟度，而且取决
14、于加工方法。其pH值与总酸度之间没有严格的比例关系，pH值的大小不仅取决于酸的数量和性质(种类)，而且受其中的酸、果胶、某些盐类和蛋白质缓冲能力的影响。,提取：一般的果蔬样品，与水11研磨，过滤；干果、籽粒，水2-3倍，沸水煮30min，过滤测定。 测定pH值测定的方法应用最广泛的有：pH试纸法、标准色管比色法和pH计测定法。其中以pH计法最准确，操作也简便、迅速，可排除或减小这些样品中所含的色泽和杂质对测定结果所造成的影响,测得较准确的数据。,pH计的型号很多，使用时参照说明书即可。pH标准溶液可以用国家计量管理机关提供的标准物质按规定配制；或按一般专业书籍上的配方配制。,水果、蔬菜等有机酸
15、组分的测定 ( 高效液相色谱法 )有机酸是果、蔬的主要组成分之一。果、蔬中有机酸的种类和含量变化很大。这些变化决定于品种、成熟度、气候条件及其它因素。果蔬中苹果酸和柠檬酸的一般含量范围见表17-1。,方法原理样品经处理后，直接将样品液注入反相化学键合相色谱体系，用5gL-1(NH4)2HPO4 为流动相，有机酸在两相中分配分离；按照其碳原子数由少到多的顺序从色谱柱中洗脱下来；用紫外检测器(214nm)或示差折光检测器或二极管阵列检测器检测并与标准样品比较定量。,操作步骤,有机酸标准溶液的制备 分别取适量有机酸单个标准样，如酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等于25mL容量瓶中，用0.01mo1/L
16、NaOH溶液溶解后定容，参照表17-1的含量范围配制标准浓度系列。,样品溶液的制备液体样品：需经合适倍数稀释，用Sep-PAK C18净化柱处理（有色素等杂质,会干扰有机酸的分析,同时造成色谱柱的污染，因此,在样品前处理中必须将其去除），收集馏出液，经0.45m微孔滤膜过滤后备用。,固体或半固体样品：要将其捣碎，均质后，加入一定量的0.01mo1/LNaOH（或80乙醇）溶液提取。经离心分离或过滤后收集提取液，用Sep-PAK C18（Waters Sep-Pak C18小柱固相萃取）净化柱处理，收集馏出液。经0.45m微孔滤膜过滤后备用。,该技术所用设备简单，价格低廉，溶剂用量较少，能够高效率、有选择地分离和富集极性不同的样品，是一种可靠性高和实用的现代分离技术。SPE 改善、简化了分离，提高了色谱柱寿命，降低了检测限,色谱条件固定相：C18键合相流动相：5gL-1(NH4)2HPO4，pH=2.5流 速：2mLmin-1进样量：10L检测器：紫外检测器，214nm，0.1AUFS,
