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1、1,分析方法验证Method Validation,2005-10,2,需要验证的分析方法,药典方法完全验证或部分验证或系统适用性试验 非药典分析方法(新建立变更修改)成品的方法(含量有关物质)残留溶剂测定方法原料中间体测定方法清洗验证分析方法的验证其它杂质研究用方法稳定性批示方法 Stability indicating methods,3,方法适用范围和可接受标准,方案中应确定,包括:化合物的成分、组成和含量辅料或添加剂定量/定性检测限和定量限线性范围精密度和准确度仪器的类型,4,验证方案的内容,验证目的:方法原理使用范围和目的.验证人员及职责(验证执行人员、组长、经理、QA):引用标准分
2、析方法SOP仪器及其操作参数需要的检验材料、试剂及标准物质等;溶液的制备:标准、样品溶液等的制备;测定的过程:如平衡时间,空白、标准、样品测定次序,系统适用性试验(项目、指标),测定参数等;计算公式及说明。,5,验证方案的内容,验证项目可接受标准验证内容验证项目1测定规程（溶液配制、测定条件、测定方法）数据表格计算公式及结果统计结论记录与图谱要求验证项目2样品测定（包括系统适用性试验等）验证评价及结论要求。验证方案的起草、审核、批准,6,验证报告内容,摘要：方法原理、检验目的和应用范围；化合物类型；验证结果及结论。验证人员及职责测定方法描述验证项目1测定规程（溶液配制、测定条件、测定方法）数据
3、表格计算公式及结果统计结论记录与图谱、标准曲线验证项目2,7,验证报告内容,样品测定（包括系统适用性试验等）验证评价及结论。起草、审核、批准。附件：SOP、验证记录、图谱、标准曲线复印件。,8,分析方法分类,标准分析方法：指法定分析方法，包括各国现行的药典（USP、EP）或其实公认的的标准参考资料中的方法。非标准化分析方法：新建立的分析方法或修改了的标准化分析方法都属于非标准分析方法。在根据方法类型，选择不同的验证项目进行分析方法验证,9,分析方法验证重视程度,验证的方法类型和内容必须反映分析的目的和API生产的步骤。原料（GB）溶剂 API包装材料 关键中间体GMP要求验证的重要性递增,10
4、,分析方法验证的前提,仪器：已校验，校验同期之内；人员：培训；熟悉方法和仪器；对照品：法定标准品、商业标准品、工作标准品；材料：试剂；容器稳定性：溶液和试剂在检验周期的稳定性，尤其使用自动进样器。方法的开发以完成，对方法草案进行验证。,11,分析方法验证检查的关注点,验证的SOP验证方案：起草、审核和批准验证项目和可接受标准验证用标准品和样品验证报告：起草、审核批准,12,标准分析方法验证,Q7A：除非所使用方法是载于现行法定药典或其它公认的标准参考资料内，分析方法应进行验证。尽管如此，所有所用方法的适用性应在实际使用情况予以证实并记录成文。两个要求：实验室必须满足标准方法规定的性能指标；标准
5、分析方法验证的数据必须充分满足实验室测定的要求。,13,标准分析方法验证,对标准分析方法进行评价，以确定需要进行验证的程度。有三种选择：不需要验证（系统适用性试验 ）部分验证和完全验证。适用性考虑的因素有：用户的仪器、人员、试剂和环境条件证明可以满足方法规定的分析要求，则只需规定和执行系统适用性试验即可，方法无需再验证；评价：化合物的类型、方法的检测限和定量限、线性范围、仪器的类型及其它的存放地和环境条件等。,14,标准分析方法验证,企业内控的要求药品申报注册要求检验方法性能的再验证一些临介项目，如杂质检查的定量限和检测限，应予以证明。,15,非标准分析方法,新建立修改或变更,16,验证的方法
6、类型,分析方法类型有四类：鉴别；杂质定量；杂质限度检查；含量原料药含量或制剂中有效成份测定；药品溶出度释放度测定。,17,分析方法的验证项目,1. Specificity(专属性)2. Precision(精密度)3.Accuracy(准确度)4.Linesrity(线性)5.Range(范围)6.Detection Limit(检测限)7.Quantitation Limit(定量限)8.Robustness(耐用性) （USP）,18,验证内容,分析方法的验证，一般根据方法的类型和检测的要求，有验证方案中拟订验证的内容和可接受标准；专属性精密度（包括重复性中间精密度）线性范围准确度检测限和
7、定量限。耐用性只有在分析方法建立的适当阶段或特殊要求时予以考虑进行验证。,19,验证的方法类型与验证内容,20,验证的方法类型与验证内容(补充),“+”代表需要“-”代表不需要（1）有了重现性验证情况下，验证可不需要,21,专属性（Specificity）定义,专属性是指在其他成份（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在的情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性；能反映该分析方法在有共存物时对供试物准确而不受干扰的测定能力。,22,专属性的测定,鉴别反应：能与可能共存的物质或结构相似的化合物区分。含量测定和杂质测定分离度评价色谱法和其他分离方法；已知的杂质定性；破坏性试验证明DAD（PDA）峰纯
8、度检查。,23,准确度（Accuracy）,准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。一般以回收率（%）表示。准确度应在不同测定项目规定的限度范围内建立。,24,准确度测定,原料药；已知纯度的对照品或样品进行测定依据线性数据结果推算制剂可用配料试验来测定收率杂质定量测定的准确度标准加入法：向制剂中加入已知量杂质测定杂质标准品准确度可接受的范围根据方法的类型、测量的浓度范围及方法的本身的要求来确定（常量、微量）,25,精密度（ Precision）,精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经过多次取样测定所得一系列结果之间的接近程度。精密度用相对标准偏差（RSD）来表示。精密
9、度有三人评价水平：重复性、中间精密度、重现性。,26,重复性（Repeatability ）,在相同操作条件下，由个分析人员在较短的时间连续测定所得结果的精密度为重复性；不同溶液制备,27,重复性测定,用100%的测试浓度至少用6次测定结果进行评价。或3个浓度（80%、100%、120%）3次重复性用RSD来评价。RSD范围应根据方法的类型、测量的浓度范围及方法本身的要求来确定。常量测定，RSD一般不大于2.0%。,28,中间精密度（Intermediate Precision）,在同一个实验室内，在不同时间或不同分析人员或用不同设备测定结果的精密度。,29,中间精密度的测定,变动因素有不同日
10、期不同分析人员不同设备。以T-检验评价（6次结果的平均值之间差异）以F-检验评价（6次结果的精密度之间差异）评价不同因素之间测定结果之间有无显著性差异。,30,重现性（Reproducibility）,在不同实验室，测定结果的精密度（也称为实验室间的精密度）。通常在分析方法药典标准化时才考虑。,31,检测限（Limit of detection, LOD）,是在指定的分析方法条件下，样品中被测物能被检出的最低量。是一种限度试验的参数，用以表示测量方法在所述条件下对样品中供试物的最低检出量，但不需要准确定量，只需指出高于或低于该规定浓度即可。通常用样品中百分浓度或 ppm表示。,32,检测限测定
11、,直观评价法（比色，TLC等）信噪比法以信噪比为23:1时相应浓度或注入仪器的量来表确定检测限。如色谱方法标准偏差和斜率法（UV、AA等）检测限=3.3SD/S检测限（%或ppm）:C min/样品浓度,33,定量限（Limit of Quantitation, LOQ）,是在指定的分析方法条件下，样品中被测物能被定量检出的最低量。其测定结果应具一定准确度和精密度。是一种含量测定的定量参数，杂质和降解产物的定量测定时应确定。通常用以样品中的百分浓度或ppm 表示。,34,定量限测定,直观评价法（比色，TLC等）信噪比法以信噪比为10:1时相应浓度或注入仪器的量来表确定检测限。如色谱方法标准偏差
12、和斜率法（UV、AA等）检测限=10SD/S检测限（%或ppm）:C min/样品浓度,35,线性（Linearity）,指在给范围内，测试结果与试样中被测物浓度呈正比的程度。或试验结果（或测得响应信号）与供试物浓度（或质量）的变化成线性关系。,36,线性测定,线性关系的测定应在规定的范围内进行。经精密稀释或称量，至少制备5份供试液。每个浓度测定13次，以测得的响应信号（或平均值）对被测物浓度进行线性回归。相关系数R越接近1.00，表明越呈线性。方法目的不同，R的要求不同。（R0.999；残留溶剂、清洗方法0.99）线性回归软件：Origin 5.0。,37,范围（Range）,分析方法的范围
13、指能达到一定的精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的样品中被测物上限和下限浓度（含量）之间的区别。通常以分析方法测定结果相同的单位表示，如%或ppm。,38,范围确定,原料药和制剂含量：80%120%；制剂含量均匀度检查，范围应为测试浓度的70%130%,其它剂型看药典。杂质测定：拟订出规定限度的50%120%。一些情况下，定量限日常测定结果150%，使测定结果在方法函盖的范围之内。如果含量测定与杂质检查同时测定，用百分归一化法，则线性范围应为杂质规定下限的-20%至含量限度（或上限）的+20%。注意：样品测定的结果应包括在方法的范围之内。,39,耐用性（Robustness）,指在测定
14、条件有较小变动时（但仍在正常允许使用范围内），测定结果不受影响的程度，也即证明方法的可靠性。开始分析方法研究时，应考虑其耐用性。如测定条件要求苛刻，则应在方法中写明。如溶液稳定性；流动相组成/pH，不同牌号色谱柱，柱温，流速等。,40,几个典型分析方法的验证案例,HPLC含量分析方法验证HPLC有关物质分析方法验证GC残留溶剂分析方法验证UV清洗验证分析方法验证,41,HPLC含量分析方法验证项目,系统适用性试验 系统精密度（峰面积的RSD）柱效分离度对称因子外加：3批样品测定（验证系统适用性）USP27新规定,42,HPLC含量测定验证的项目,43,HPLC有关物质分析方法验证的项目,系统适
15、用性试验 系统精密度（峰面积的RSD）n=5 or 6柱效分离度对称因子,44,验证的项目,45,HPLC有关物质分析方法验证报告评述,关键点：杂质对照品：原料、中间体、付产物、降解产物线性范围每个杂质的LOD、LOQ,46,残留溶剂分析方法验证项目,系统适用性试验 系统精密度（峰面积的RSD）n=6柱效分离度对称因子,47,残留溶剂验证项目,48,USP OVI,USP有机挥发性杂质OVI四个溶剂：氯仿、二氯甲烷、1,4二氯六环、三氯乙烯专论规定工艺未使用，不用检测。,49,EP 残留溶剂,EP 4.8残留溶剂（四类溶剂）5.4 Residual solvents 残留溶剂目录和限度2.4.24. Identification and control of residual solvents 残留溶剂测定方法规程（选择其一）LIMITS OF RESIDUAL SOLVENTS4.1. SOLVENTS TO BE AVOIDED 苯4.2. SOLVENTS TO BE LIMITED4.3. SOLVENTS WITH LOW TOXIC POTENTIAL4.4. SOLVENTS FOR WHICH NO ADEQUATE TOXICOLOGICAL DATA WAS FOUND,
