《两种CpG ODN佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《两种CpG ODN佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1两种 CpG ODN 佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究作者：何爱丽,陈 虹, 张王刚,曹星梅,赵万红【摘要 】 为了比较免疫佐剂 CpG ODN1826 和 CpG ODN2006在白血病局灶肿瘤动物模型中的抗瘤作用和毒副作用，筛选合适的免疫佐剂，建立了急性淋巴细胞白血病局灶肿瘤动物模型，在不同时间用灭活的 L1210 细胞和不同免疫佐剂给 DBA/2 小鼠皮下注射，观察小鼠一般状况、成瘤率、瘤块生长情况，了解瘤块病理情况。结果表明：灭活细胞加 CpG ODN1826 瘤苗可以降低小鼠成瘤率，成瘤小鼠的瘤块生长缓慢，瘤块内部肿瘤细胞坏死明显，但生存期无明显延长；CpG ODN2006 组
2、小鼠成瘤率不但降低，瘤块缩小，而且生存期也明显延长，已生长的肿瘤消退。结论：应用 CpG ODN2006 瘤苗可以增强白血病局灶肿瘤小鼠的抗瘤作用，使生存期明显地延长，无明显的毒副作用。 【关键词】 白血病Antitumor Effect of Two Adjuvants of CpG ODN on Leukemic Tumor in Mouse Models2Abstract To investigate the antitumor and side effect of CpG ODN 1826 and CpG ODN2006 as an adjuvants on leukemic tumo
3、r in mousemodels, an acute lymphocytic leukemic tumor in mouse model was established, then inoculated inactivated L1210 cells alone or with different vaccine adjuvants were injected subcutaneously into each DBA/2 model mouse at different times. The activities of mice, the tumor formation rate and th
4、e growth status of leukemic tumor were observed. The tumor was examined by pathologic section. The results showed that the vaccine of inactivated L1210 cells and CpG ODN 1826 could decrease the leukemic tumor formation rate, slow down the growth of leukemic tumor mass in mice and obviously cause nec
5、rosis of tumor cells, but it could not prolong the life spans of the tumorburden mice; while CpG ODN2006 could not only decrease the tumor formation rate, slow down the growth of tumor mass in mice and result in obvious necrosis of tumor cells, but also could eliminate the existing tumor mass in mic
6、e, and prolong the life spans of the tumorburden mice. It is concluded that using CpG ODN2006 as an adjuvant enhances the antitumor effect against the leukemic tumor, prolong 3the life span of tumorburden mice without obvious side effect.Key words leukemia; tumor vaccine; cytidinephosphatteguanonine
7、 oligodeoxynucleotides白血病的免疫治疗，长期以来一直受到人们的重视。随着生物科学技术的发展，肿瘤疫苗已经从早期的单纯灭活肿瘤细胞疫苗到今天的利用生物工程建立基因修饰肿瘤疫苗等多种形式。我科曾经应用白血病瘤苗，主动免疫治疗白血病患者，取得了良好疗效1 ，但大多患者注射局部红肿硬结，疼痛，很难坚持治疗，这提示我们寻找作用效果更好、副作用更小的免疫佐剂。我们通过白血病局灶肿瘤动物模型观察免疫佐剂 CpG ODN1826 和 CpG ODN2006 的抗白血病局灶肿瘤作用和毒副反应，为临床治疗提供实验依据。材料和方法动物及肿瘤细胞DBA/2 小鼠，雌雄各半共 38 只，体重 22
8、-28 克，购自第四军医大学动物中心，为二级清洁动物。小鼠白血病细胞株 L1210 由西安交通大学生命科学院惠赠。4两种 CpG ODN 佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究 主要试剂GpG ODN1826 TCCATGACGTCCCTGACGTT 全硫逐磷酸骨架，CpG ODN2006 TCGTCGTTTCGTTTT GTCGTT 全硫逐磷酸骨架，为 Coley 公司产品；丝裂霉素 C 购于上海金康制药公司。小鼠白血病模型的制备取对数生长期的 L1210 细胞，用 PBS 洗 3 遍，调整浓度至1105/ml，于每只小鼠右肋下皮肤分别注射 0.1 ml（即 5104 个肿瘤细胞） ，5-7
9、天后可触及皮下结节。小鼠肿瘤疫苗的制备收获处于对数期生长的 L1210 细胞，800 rpm 离心 8 分钟，加入丝裂霉素 C（终浓度为 100 g/ml） ，于 37水浴中放置 30 分钟，用 PSB 液洗涤 3 遍后，调整细胞浓度至 2107/ml，作瘤苗备用；将 CpG ODN1826 和 CpG ODN2006 用 PBS 液分别溶解后，调整浓度至 500 g/ml，备用。5实验分组将小鼠随机分为 4 组（每组小鼠雌雄各半） ，每组 9-10 只小鼠：CpG ODN1826 组：CpG ODN1826（0.1 ml，50 g）+灭活的肿瘤细胞（0.1 ml，2106 个） ；CpG O
10、DN2006 组：CpG ODN2006（0.1 ml，50 g）+灭活的肿瘤细胞（0.1 ml，2106个） ；单独治疗组：生理盐水（0.1 ml）+灭活的肿瘤细胞（0.1 ml） ；阴性对照组：生理盐水（0.2 ml） 。免疫治疗于接种肿瘤细胞后的第 2，5，8，15 天分别给 4 组小鼠在接种部位对侧肋下皮下注射疫苗或生理盐水 0.2 ml。观察并记录每 1-2 天，观察记录小鼠的局部注射部位有无红肿、硬结、溃烂等；观察记录小鼠的一般状况、体重变化、食量大小以及是否有惊厥、竖毛、抽搐等现象持续 90 天。应用游标卡尺测量小鼠肿块大小2 。病理学检测6切取原接种肿瘤部位、注射疫苗部位皮肤以
11、及心肝脾肾等重要脏器，HE 染色，观察肿瘤细胞及炎性细胞浸润情况3 。统计学分析以及处理以统计学软件（Original lab）对资料进行统计学处理，成瘤率采用四格表确切概率法；生存时间采用成组设计的两样本配对 t 检验；p0.05 为有显著差异。结 果不同时期免疫治疗后小鼠肿瘤生长情况免疫治疗后不同时期小鼠肿瘤生长见表 1-3。 CpG ODN1826组的 5 只小鼠虽然没有肿瘤生长，但 4 只小鼠全身衰竭死亡，有 2只小鼠出现肿瘤消退现象，CpG ODN2006 组成瘤率已明显下降，有 3 只小鼠肿瘤已不能触及（表 1、2、3 ） 。疫苗治疗后各组小鼠一般状况的观察正常 DBA/2 小鼠精
12、神好，活泼，被毛光滑。小鼠接种肿瘤后，毛发无光泽，杂乱；随着肿瘤的生长，小鼠精神萎靡，活动明显减7少，肿瘤生长 2 cm2 cm 后，瘤体局部出现破溃、出血，小鼠全身衰竭，恶液质，4 组无明显差异（ 20 天内） 。接种肿瘤细胞 20 天后，在 CpG ODN1826 组与 CpG ODN2006 组中发现个别小鼠肿瘤消退。在阴性对照组小鼠中发现小鼠尾部有多处隆起。CpG ODN1826 组和 CpG ODN2006 组注射后局部形成包块，吸收较快，小鼠无惊厥、躁动，1-2 天后包块消失，未发现明显红肿及破溃现象。免疫治疗后各组小鼠的生存时间比较CpG ODN2006 组、CpG ODN182
13、6 组、单独治疗组和阴性对照组各有 6 只、2 只、2 只和 1 只小鼠活存（90 天） ，CpG ODN2006 组小鼠的活存期与其它组相比，有显著性差异（附图） 。Figure. Comparisons of life spans between diverse groups of mice.病理检查结果肿瘤病理 CpG ODN1862 组、CpG ODN2006 组和单独治疗组肿瘤生长活跃，镜下可见大量肿瘤细胞生长，并广泛浸润脂肪组织，没有侵袭至肌肉组织。长期生存的小鼠在肿瘤注射部位未发现肿瘤细胞，在重要脏器中未发现肿瘤细胞转移灶。阴性对照组肿瘤8细胞广泛浸润脂肪组织，部分浸润至周围横纹
14、肌组织。肝、肺转移情况 在所有接种肿瘤细胞的小鼠肺脏中，均未见白血病肿瘤细胞，提示肺部转移可能性小。CpG ODN1862 组和 CpG ODN2006 组在肝血窦以及肝实质内未发现肿瘤细胞转移灶。单独治疗组部分小鼠肝脏内发现了肝血窦内瘤细胞浸润。阴性对照组中4 只小鼠有肝脏内瘤转移，少数小鼠肝细胞变性坏死，长期生存小鼠有肝细胞颗粒样变性。脾脏情况 在 CpG ODN1862 组中没有发现肿瘤的 4 只小鼠中，有 2 只小鼠的脾脏组织巨噬细胞增生，肿大，淋巴滤泡结构不清，未见生发中心。长期生存的小鼠脾脏未见明显病理变化。其余各组脾脏组织结构基本正常。尾部情况 阴性对照组 4 只小鼠尾部出现单个
15、和多个结节，镜下可见局部早期急性脓肿，未见肿瘤组织和细胞浸润情况，其余 3 组尾部肉眼观察与病理切片显示均无异常。讨 论肿瘤的疫苗研究主要有两方面，肿瘤抗原和免疫佐剂的研究。随着对机体逃避免疫监视机制的深入研究，人们认识到佐剂在肿瘤免9疫治疗中发挥着很重要的作用，它能提高免疫原性，逆转机体的免疫无能状态，改变机体的免疫应答方向4 。CpG ODN 作为强而有效的免疫刺激剂，一直受到研究者的重视。我们选取的两种 CpG序列均为 B 型 CpG 序列。根据文献报道5,6 ，A 型 CpG ODN主要依靠激活 NK 细胞发挥抗肿瘤作用，单独应用于局部的实体瘤效果较好，而 B 型 CpG OND 能激
16、活多种细胞因子的产生，上调免疫细胞表面的分子表达，推测其作为免疫佐剂效果更佳。前期的研究表明，CpG ODN1826 虽然在白血病小鼠模型中有一定的抗白血病免疫作用，但后期未发生肿瘤小鼠的死亡率增加，提示 CpG ODN1826 在免疫治疗中有一定的缺陷，还需要对它进行改进或寻找效果更好副作用更少的免疫佐剂。通过建立小鼠白血病局灶肿瘤模型，应用两种不同的 CpG ODN佐剂和灭活细胞作为瘤苗观察它们的抗瘤作用，结果显示 CpG ODN2006 组小鼠的成瘤时间与成瘤率与阴性对照组小鼠无显著性差异，随着实验的进行，接受过免疫治疗的小鼠肿块中央出现出血、坏死，并逐渐消退，小鼠一般状况好转，病理切片显示未发生肝脏和肺的转移灶，6 只小鼠均长期生存至实验结束（90 天） ，而 CpG ODN1826 组未成瘤的小鼠衰竭明显，并在短时间内死亡；其它 2组肿瘤细胞生长迅速，有肝脏转移灶，说明 CpG ODN2006 能够作为免疫佐剂
