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1、1两步法扩增诱导脐血及动员外周血 CD34+细胞来源树突状细胞的比较作者：王亚非 孟恒星 葛薇 于珍 李云涛 李桥川 万长春徐燕 李新 李增军 王国蓉 尤胜国 邱录贵 【摘要 】 为了比较先扩增、后诱导的两步法从脐血（CB）CD34细胞和动员外周血（MPB）CD34细胞诱导所得 DC 的产量及功能，将免疫磁珠分选获得的 CB-CD34+细胞和 MPB-CD34细胞用 FL、TPO、SCF、GM-CSF 等细胞因子先扩增 10 天，然后加入 GM-CSF、 IL-4 及 TNF-、CD40Ab、PGE2 等细胞因子组合诱导获得 DC。采用流式细胞仪检测 DC 表型，混合淋巴细胞培养检测 DC 刺
2、激异基因 T 细胞增殖能力，ELISA 法检测 DC 分泌 IL-12 能力，Transwell 板检测 DC 在次级淋巴组织趋化因子（SLC ）介导下的趋化功能。结果表明： 扩增 10 天时 CB 组、MPB 组细胞中 CD14+CD1a-细胞含量无显著差异（40.4816.85 ）% vs （28.0723.19 ） %， P0.05 。但由于 CB 组细胞扩增倍数显著高于 MPB 组（388.8884.63 倍 vs 79.6710.32 倍， P0.01） ，CB 组 CD14+CD1a-细胞扩增倍数显著高于 MPB 组（189.4225.02 倍 vs 28.7423.27 倍， P
3、0.01） ； TNF-/CD40Ab/PGE2 条件下与 TNF- 条件下相比，CB 组和 MPB 组2所得 DC 均表达更高的 CD83分别为（34.5211.22 ）% vs （3.702.27）% 、 （36.6913.36）% vs （7.343.364）%， P均0.01 ； CB 组与 MPB 组在 TNF-/CD40Ab/PGE2 诱导条件下所得 DC 均高水平表达 CD83、CD86、HLA-DR、CD11c、CD54 、 CD40，CB 组所得 CD83+细胞的扩增倍数显著高于 MPB 组（198.72117.53 倍 vs 33.956.19 倍，P0.05） 。结论：
4、在两步法培养体系下，CB-CD34+细胞与MPB-CD34+细胞来源的 DC 具有相同的功能，而前者产量显著高于后者。 【关键词】 树突状细胞 脐血 动员外周血 CD34细胞 两步法培养法Comparison of Expanding Dendritic Cells Derived from Cord Blood and Mobilized Peripheral Blood by Two-step Culture MethodAbstractTo compare the expansion efficiency and 3function of dendritic cells derived
5、from CB-CD34+ cells and MPB-CD34+ cells by using two-step culture method， enriched CB-CD34+ cells or MPB-CD34+ cells with immunoadsorption were primarily cultured in the presence of FL, SCF, TPO， GM-CSF for 10 days, and then further cultured with a combination of GM-CSF,IL-4,TNF-,CD40Ab and PGE2 to
6、induce DC. The DC phenotypes were detected by flow cytometry, the expansion efficiency and cell function were evaluated by mix-lymphocyte reaction(MLR), IL-12 level was detected by using ELISA and the chemotactic function mediated by secondary lymphoid tissue chemokine (SLC) was determined with Tran
7、swell plate. The results indicated that after 10 days of expansion, there were no significant difference in the percentage of CD14+CD1a- cells between CB and MPB (40.4816.85)% vs (28.0723.19)%， P0.05, but the expansion of total cells in CB was higher than that in MPB (388.8884.63-fold vs 79.6710.32-
8、fold， P0.01), so the yield of CD14+CD1a- cells from CB was significantly higher than that from MPB too (189.4225.02-fold vs 28.7423.27-fold， P0.01). The percentage of CD83+ DCs cultured with CD40Ab/PGE2 derived from CB were higher than those cultured with TNF- 4derived from MPB respectively (34.5211
9、.22)% vs (3.702.27)% and (36.6913.36)% vs (7.343.364) % respectively, P0.01. In the same circumstance, the yield of CD83+ DCs derived from CB was much more than that from MPB (198.72117.53 times vs 33.956.19 times， P0.01) . There were no difference in stimulating capacity, IL-12 secretion and migrat
10、ion capacity between DCs derived from CB and MPB. It is concluded that DCs induced from CB-CD34+ cells by two-step culture possesse similar functions with that from MPB-CD34+ cells, but the yield of DCs from CB CD34+ cells is much more than that from MPB CD34+ cells.Key wordsdendritic cell; cord blo
11、od; mobilized peripheral blood; CD34+ cell; two-step culture method采用先扩增后诱导的两步法从 CD34细胞诱导获得树突状细胞（dendritic cell， DC）可以在保证 DC 功能的基础上显著提高 DC 产量1 。脐血（cord blood， CB）与骨髓（BM） 、动员的外周血（mobilized peripheral blood, MPB）相比，其 CD34细胞含量更高、增殖潜能更大，因此更适于两步法大量诱导 DC。但有文献报道，CB 单核细胞（Mo）来源的 DC（CBMo-DC ）与成5人外周血（APB）Mo 来源
12、 DC（APBMo-DC）相比，具有产量低、抗原捕获能力弱及刺激异基因 T 细胞增殖能力低下等缺点2 。而两步法中第二步的诱导实际上是从 CD14+CD1a-细胞开始的1 ，类似于从 Mo 诱导 DC 的体系。因此，两步法从 CB-CD34+细胞诱导所得 DC 是否也存在功能缺陷，有关研究目前国内外均未见报道。为此，设计了本研究，以比较在我们所建立的体系中 CB-CD34+细胞及 MPB-CD34+细胞来源 DC 的产量及功能，从而评价两步法从CB-CD34细胞诱导获得 DC 的可行性。材料和方法材料CD34+细胞及 CD3+细胞免疫磁珠分选试剂盒购自 Miltenyi Biotec 公司;
13、SCF、TNF-、TPO 及次级淋巴组织趋化因子（SLC ）购自 Peprotech 公司; IL-3、前列腺素 E2（PGE2） 、IMDM、四甲基偶氮唑盐(MTT) 购自 Sigma 公司; FL 由 Immunex公司惠赠，活化型 CD40Ab 由苏州大学医学院免疫学研究所张学光教授惠赠; GM-CSF 购自 Schering-Plough 公司; IL-4 购自Stemcell Techniologies 公司; FITC 标记鼠抗人CD1a、CD83、CD86、CD40 、CD3、HLA-DR、CD34 单克隆抗体购自 Becton Dickinson 公司; 淋巴细胞分离液(Fic
14、oll，密度61.077) 购自 TBD 生物工程有限公司 ; 60 g/L 羟乙基淀粉购自Braun Medical 公司;胎牛血清(FCS) 购自 Gibco 公司; IL-12 ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司;Transwell 板（8 m）购自Corning 公司。CD34+细胞的分离纯化与扩增在无菌条件下取足月顺产胎儿 CB,用 60 g/L 羟乙基淀粉沉淀红细胞后 Ficoll 液分离获得单个核细胞（MNC） ，对于 MPB 则直接用 Ficoll 液分离获得 MNC，将 MNC 与 CD34+细胞免疫磁珠孵育 30 分钟,让细胞通过置于磁场中的分离柱后加压洗脱,获得
15、CD34+细胞。将 2.0104/ml CD34+细胞接种于含 10% FCS 的IMDM，加入 FL 100 ng/ml、TPO 100 ng/ml、SCF 50 ng/ml及 GM-CSF 100 ng/ml。培养第 4 天加入等体积新鲜培养液（含相同浓度的 FL、TPO、 GM-CSF，半量浓度的 SCF） 。培养第 7 天、第 10 天维持细胞浓度为 2.0105/ml 左右，并添加与第 4 天相同浓度细胞因子的新鲜培养液。培养第 10 天收集细胞进行计数、表型检测并开始诱导。DC 的诱导将扩增 10 天的细胞用含 GM-CSF 100 ng/ml、IL-4 20 7ng/ml 的完全 IMDM 调整细胞密度为 5105/ml,并接种于 25 cm2培养瓶中，每 3 天半量换液并补充 GM-CSF、IL-4 ，第 6 天换液时加入 40 ng/ml 的 TNF-、40 U/ml 的 CD40Ab、10-7mol/L 的PGE2 等细胞因子（组合） ，第 8 天收获细胞。T 细胞的获得无菌条件下用肝素抗凝管采集健康成人外周血 10 ml， Ficoll 液分离的 MNC 与 CD3+细胞免疫磁珠孵育 30 分钟,让细胞通过
