《两步串联层析法纯化鼠抗人CD28单克隆抗体2F5》由会员分享，可在线阅读，更多相关《两步串联层析法纯化鼠抗人CD28单克隆抗体2F5（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1两步串联层析法纯化鼠抗人 CD28 单克隆抗体 2F5作者：马泓冰, 孙中文, 徐颖, 李文香, 陶然 , 陈洁, 张学光【关键词】 固相化金属螯合层析法;,凝胶过滤层析法;,纯化;,单克隆抗体摘 要 目的: 建立从小鼠腹水中纯化鼠抗人 CD28 单克隆抗体(mAb)2F5 的两步串联层析法。方法: 将含 mAb 2F5 的腹水经离心、 过滤及缓冲溶液变换预处理后, 先经固相化金属螯合亲和层析法(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)纯化, 去除大部分杂蛋白, 再经凝胶过滤层析法(gel filtration, GF)精细纯化, 并探
2、讨了上样的流速和洗脱液的种类对 mAb 2F5 纯度的影响。纯化的 mAb 2F5 的生物学活性用 3HTdR 掺入法进行分析。结果: 以两步串联层析法纯化的鼠抗人 CD28 mAb 2F5 的纯度大于 90%, 总回收率达 70%。纯化的 mAb 2F5 在体外对 PBTC 具有明显的促增殖作用; 而且其促增殖作用的活性优于 Protein G 亲和层析法（affinity chromatography, AC）纯化所获得 mAb。结论: 建立的两步串联层析纯化方法操作简便, 所得 mAb 的纯度高、 生物学活性好。关键词固相化金属螯合层析法 ; 凝胶过滤层析法; 纯化; 单2克隆抗体CD2
3、8 分子在信号转导及自身免疫性疾病等中的作用已成为目前研究的热点1, 2。为了深入研究其功能, 本研究小组制备了鼠抗人 CD28 单克隆抗体（mAb）2F5, 并研究了其纯化方法。目前纯化 mAb 的方法很多, 如离子交换3、 疏水层析 4及亲和层析5等,这些方法各有其优缺点, 固相化金属螯合亲和层析法（ IMAC）是近年来发展起来的一项新型分离技术, 具有配基简单、 不易泄漏、 吸附量大、 分离条件温和及通用性强等优点, 已成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一6, 但尚未见用于纯化小鼠腹水中 mAb 的报道。由于小鼠腹水中含有某些杂蛋白成分, 单独使用IMAC 法时 , 往往达不
4、到较好的纯化效果, 通常需要串联其他层析法进行纯化才能获得高纯度的活性抗体7。我们采用 IMAC 与凝胶过滤（GF）两步串联的层析法, 对小鼠腹水中鼠抗人 CD28 mAb 2F5进行了纯化。建立的方法具有操作简单、 mAb 纯度高及生物学活性好等特点。1 材料和方法1.1 材料 含 mAb 2F5 的小鼠腹水由本室制备。外周血 T 细胞（PBTC）由通过 Ficoll 密度梯度法和磁珠阴性选择去除 CD19、 CD56 阳性细胞后获得。BioLogic DuoFlow 中高压层析仪（检测3波长为 280 nm） 、 IMAC 层析柱（1.0 cm3.2 cm, 内填装有末螯合 Ni2+的填料
5、） 、 GF 层析柱（1.0 cm64 cm, P100 填料, 分离范围 5000100100 Daltons） 、 脱盐层析柱（2.5 cm10 cm, P6填料, 分离范围 10006000 Daltons） 、 MiniProtean 3 电泳仪、 SmartSpec3000 紫外可见分光光度计、 Gel Doc1000 凝胶成像系统及蛋白质 Lowry 法定量试剂盒 , 均为 BioRad 公司产品。其他试剂均为分析纯试剂。1.2 方法1.2.1 IMAC 层析柱纯化 将装填好的 IMAC 层析柱连接到层析仪上, 对 IMAC 填料进行 Ni2+螯合(参见填料说明书)后, 用 5 倍
6、柱体积（CV）的上样缓冲液 A（以咪唑浓度梯度洗脱时 , 上样条件为 pH8.0 的 50 mmol/L PB+5 mmol/L 咪唑; 其他洗脱条件时, 为pH8.0 的 50 mmol/L PB+0.5 mol/L NaCl）充分平衡层析柱。取含有 mAb 2F5 的小鼠腹水 5 mL, 加入适量的 SiO2 粉末, 振荡 30 min, 以 9000 r/min 离心 20 min。取上清, 过 0.22 m 滤膜, 加入到经缓冲液 A 平衡的脱盐柱并以缓冲液 A 做为流动相进行洗脱, 接收洗脱流份, 置 4待用。取 500 L 经上述预处理后的样品上样（流速依据实验条件的不同分别调整为
7、 0.1、 0.3、 0.6、 1.0 mL/min） , 用洗脱缓冲液 B（洗脱条件依据实验条件的不同, 分别采用 pH8.04.0 的梯度、0 1.0mol/L NH4Cl 的浓度梯度和410300mmol/L 咪唑的浓度梯度）进行洗脱。洗脱步骤为: 100%A 液洗脱 10CV, 用 0%100%B 液洗脱 10CV, 再用 100%B液洗脱 4CV, 洗脱流速为 1.0 mL/min, 收集蛋白峰。1.2.2 GF 层析柱纯化 将装填好的 GF 层析柱连接到BioLogic DuoFlow 中高压层析仪上, 用缓冲液（pH72 的 20 mmol/L PBS）充分平衡层析柱后 , 以
8、IMAC 层析柱的洗脱馏份为样品上样, 上样及洗脱的流速均为 0.2 mL/min, 收集蛋白峰。1.2.3 纯化的 mAb 2F5 的 SDSPAGE 鉴定 取纯化的 mAb 2F5 样品在还原条件下进行 SDSPAGE（分离胶浓度为 100 g/L, 浓缩胶浓度为 50 g/L） 。电泳后, 以考马斯亮蓝 R250 染色, 再经凝胶成像仪扫描鉴定 mAb 2F5 的纯度。纯化的 mAb 2F5 的浓度采用Lowry 法试剂盒进行定量。1.2.4 mAb 2F5 促进 PBTC 增殖的作用 采用 3HTdR 法。以激发型鼠抗人 CD3 mAb（0.25 mg/L）包被 96 孔板（100 m
9、L/孔）, 加入一定密度(5106/mL)的细胞悬液（100 mL/孔）, 然后分别加入经 IMAC+GF 两步串联层析法及常规 Protein G 亲和层析法9纯化的不同浓度（0.1 、 0.25、 0.5、 1.0、 2.5 mg/L）的 mAb 2F5, 同时设小鼠 IgG1 同型及只加激发型抗 CD3 mAb 的对照组。培养 56 h 后, 加入 3HTdR(3.7104 Bq/孔), 继续培养至 72 h, 采5用液闪仪测定各孔的 cpm 值。2 结果2.1 mAb 2F5 的纯化及鉴定 (1)IMAC 层析柱上样流速的条件: 在 PB 缓冲溶液（pH 8.050 mmol/L+0.
10、5 mol/L NaCl）条件下上经过预处理的腹水样品, 采用 pH (8.04.0)梯度洗脱。分别试验了 0.1、 0.3、 0.6、 1.0 mL/min 的上样流速, 洗脱流速均为 1.0 mL/min。结果表明 , 目的蛋白均可与 IMAC 层析柱中螯合了 Ni2+填料结合并被洗脱。在低流速（0.3 mL/min）下上样时, 穿透液中无目的蛋白成分, 而在高流速（0.3 mL/min）条件下上样时, 则有目的蛋白成分穿透。考虑到纯化的效率, 最终选择的上样流速为 0.3 mL/min。不同上样流速条件下纯化的 mAb 2F5 的SDSPAGE 分析, 结果见图 1。图 1 以不同上样流
11、速条件进行 IMAC 柱层析纯化 mAb 2F5的 SDSPAGE 分析（略）M: 蛋白 marker; 1, 3, 5, 7: 以 0.1、 0.3、 0.6、 1.0 mL/min 上样流速时的流出组分; 2, 4, 6, 8: 以 0.1、 0.3、 0.6、 1.0 mL/min 上样流速时的洗脱组分.（2）IMAC 层析柱洗脱的条件: 在 PB 缓冲溶液（pH8.0 50 6mmol/L+0.5 mol/L NaCl）条件下上经过预处理的腹水样品, 分别采用 pH 梯度（ pH8.050 mmol/L PB+0.5 mol/L NaClpH4.050 mmol/L NaACHAC+0
12、.5 mol/L NaCl） 、 01.0 mol/L NH4Cl和 10300 mmol/L 咪唑浓度梯度洗脱（以咪唑的浓度梯度洗脱时, 上样条件为 pH8.050 mmol/L PB 含 5 mmol/L 咪唑） 。结果表明, 采用 pH 梯度洗脱时 , 所得 mAb 的纯度高（80%, 凝胶成象仪扫描）、 回收率高（ Lowry 法测定腹水原液的蛋白浓度为 54.1 g/L, 凝胶成象仪扫描鉴定其含 IgG 为 10%, 图 2 洗脱峰 2 的蛋白浓度为 2.08 g/L, 收集量为 1.3 mL, 则回收率为2.081.380%/54.10.510%=80%）, 不同洗脱条件纯化的mA
13、b 2F5 的 SDSPAGE 结果见图 2, mAb 2F5 的 IMAC 柱层析纯化结果见图 3。(3)GF 层析柱纯化: 腹水 mAb 2F5 经上述 IMAC 层析法纯化后, 经 SDSPAGE 鉴定目的 mAb 的纯度仍不高（ 80%）, 故需用GF 层析法再进行纯化。即取 IMAC 层析柱洗脱的活性组份, 加入到经缓冲液(pH7.2 的 20 mmol/L PBS)平衡的 GF 层析柱中并用该缓冲液洗脱, 收集洗脱峰, 经 SDSPAGE 鉴定, 两步串联层析后, mAb 2F5 的纯度可达 90%以上（图 4） 。mAb 2F5 的 IMAC 柱层析纯化结果见图 5。图 2 以不
14、同洗脱条件进行 IMAC 柱层析纯化的 mAb 2F5 的7SDSPAGE 分析（略）M: 蛋白 marker; 1, 3, 5: 以不同的 pH 梯度、 NH4Cl 梯度及咪唑梯度洗脱的流出组分; 2, 4, 6: 以不同的 pH 梯度、 NH4Cl梯度及咪唑梯度洗脱的洗脱组分.图 3 由 IMAC 层析柱采用 pH 梯度洗脱纯化 mAb 2F5 的层析图（略）: 流穿峰的组分; : mAb 2F5 的洗脱峰.图 4 采用两步串联层析法纯化的 mAb 2F5 SDSPAGE 分析（略）M: 蛋白 marker; 1: 从 IMAC 柱中洗脱的组分; 2: 从IMAC+GF 柱中洗脱的组分.图
15、 5 由 IMAC+GF 层析柱两步串联法纯化 mAb 2F5 的层析图（略）: 目的蛋白的组分; : 盐小分子的洗脱峰.82.2 mAb 2F5 促进 PBTC 增殖的作用 3HTdR 掺入法检测表明, 激发型 mAb 2F5, 能有效地协同抗 CD3 mAb 激发 PBTC 的活化和增殖效应（图 6） , 且其促增殖作用优于用实验室常规的Protein G 亲和层法纯化的 mAb 2F5。图 6 mAb 2F5 在体外促进 PBTC 增殖的作用（3HTdR 法）（略）3 讨论IMAC 法已成为蛋白质分离纯化中所用最广泛的亲和层析方法之一。该法分离纯化蛋白质的原理主要是利用蛋白质表面的一些氨
16、基酸, （如组氨酸、 色氨酸、 赖氨酸等 Lewis 碱）可与弱的水合固相化的过渡金属离子（Cu2+、 Zn2+、 Fe2+、 Co2+、 Ni2+）相结合 , 结合能力的大小除与蛋白质表面暴露的氨基酸残基数量有关外, 还与结合位点的空间分布是否有利于与金属离子的结合有关。因而, 采用合适的上样及洗脱条件, 便可将目的蛋白与杂蛋白分离。该法具有交换载量大, 分离条件温和 , 通用性强, 易于放大等特点, 特别是在纯化 mAb 的过程中, 由于洗脱条件的温和, 可较好地保持 mAb 的生物学活性, 因而越来越受到人们的重视。在IMAC 法中 , 由于蛋白质的氨基酸残基与金属离子的结合是一个动态平衡的过程, 因而, 不同的上样流速可影响蛋白质与 IMAC 层析柱的9动态结合。在低流速条件下, 蛋白质可全部保留在 IMAC 层析柱的介质上, 有较高的动态载量; 而在高流速条件下,
