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1、1丙戊酸钠抑制 HL-60 细胞增殖并诱导其凋亡与分化作者：韩冬梅，陈协群，梁蓉，董宝侠，尹文 【摘要 】 为进一步研究丙戊酸钠（sodium valproate；VPA）对白血病细胞 HL-60 的增殖、凋亡和分化的影响，采用 MTT 法检测不同浓度的 VPA 对 HL-60 细胞增殖的作用；细胞化学染色法观察药物作用后细胞形态的变化；NBT 还原实验结合形态学作为观测细胞分化指标；应用流式细胞术检测不同浓度药物作用后细胞周期的变化及凋亡细胞的比例。结果显示：VPA 能明显抑制 HL-60 的增殖；经 2 mmol/L VPA 处理 24-48 小时后， HL-60 出现胞浆空泡、核固缩、核
2、碎裂及凋亡小体；Annexin V 阳性的早期凋亡细胞比例由 2.9%升高到 17.1%；流式细胞术检测出明显的亚二倍体峰；G1期细胞由 51.1%增加至 84.6%，S 期细胞由 37.9%减低至14.4%。0.25 mmol/L VPA 作用 1 周后，促进 HL-60 细胞向中幼粒、晚幼粒阶段分化，NBT 阳性细胞百分率为（ 472）% 。结论：VPA 能明显抑制白血病细胞 HL-60 的增殖，并诱导其分化及凋亡。 【关键词】 丙戊酸钠2Inhibition of Proliferation and Induction of Apoptosis and Differentiation o
3、f Leukemic Cell Line HL-60 by Sodium ValproateAbstract To investigate the influence of sodium valproate (VPA) on proliferation，apoptosis and differentiation of HL-60 cell line，effect of VPA in various concentrations on proliferation of HL-60 cells was detected by MMT；Wright-Giemsa staining was perfo
4、rmed to observe the morphologic changes of HL-60 cells；NBT experiment was used to test the differentiation of HL-60 cells；flow cytometry was used to observe cell cycles and analyze the apoptosis. The results indicated that the changes of the growth curve showed inhibition of proliferation of HL-60 c
5、ells. After a 24-48 hours culture with 2 mmol/L VPA，the cells exhibited nuclear shrinkage，pyknosis fragmentation and appearence of apoptosis bodies. The percentage of the annexin V+/PI- cells which were apoptotic increased from 2.9% to 17.1%；hypodiploid peak was observed；the percentage of HL-60 cell
6、s in G1 phase increased from 51.1% to 84.6% and the cells in S phase decreased from 37.9% to 14.4%. After a week culture with 0.25 mmol/L VPA，the cells exhibited 3characteristics of differentiation. The percentage of NBT positive cells was (472)%. It is concluded that VPA can inhibit the proliferati
7、on of HL-60 cells while inducing differentiation and apoptosis of these cells. The mechanism needs to be further studied.Key words sodium valproate；HL-60 cell；cell proliferation；cell apoptosis；cell differentiation组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase，HDAC ）抑制剂在体外对于多种肿瘤细胞系有抑制细胞增殖、诱导凋亡及分化的作用。HDAC 抑制剂对肿瘤细胞有选择性细
8、胞毒性，而对正常造血细胞无严重毒性，且与多种现有化疗药物有协同作用1 ，在最近HDAC 抑制剂已经开始 I /II 期临床试验。丙戊酸钠 (sodium valproate，VPA)是治疗癫痫的一种传统药物，毒副作用较小。最近发现，其在药理学水平有着 HDAC 抑制剂的特征性作用，可诱导肿瘤细胞分化与凋亡2 。本试验以急性髓性白血病细胞 HL-60 为靶细胞，进一步探讨 VPA 对白血病细胞增殖、凋亡和分化的影响。材料和方法试剂4VPA 由连云港制药厂生产，西京医院药剂科惠赠，纯度 99.4%，分子式为 C8H15NaO2，以去离子水配制成 0.4 mol/L 浓度，过滤分装，贮存于-20 。
9、小牛血清购自民海生物工程有限公司。四氮唑蓝（MTT） 、佛波酯（TPA）为 Sigma 公司产品。硝基蓝四氮唑（NBT）为华美生物工程公司产品。实验方法细胞培养急性髓性白血病细胞系 HL-60 来源于 ATCC，由第四军医大学病理学教研室惠赠。细胞培养于含 10%灭活小牛血清的 RPMI 1640 培养液（含青霉素、链霉素各 0.1 U/L）中，置 5% CO2 饱和湿度、37培养箱中悬浮培养，2-3 天换液 1 次，实验用细胞处于对数生长期。MTT 比色试验取对数生长期 HL-60 细胞接种于 96 孔板，每孔接种 1 500个细胞。根据预实验设 VPA 浓度为 4、2、 1 和 0.5 m
10、mol/L，在相同实验条件下，处理组中细胞分别加入不同浓度的 VPA。每个浓度5设 4 个平行孔，分别于加药后 2、3、4 、5、6 天检测，于每次检测前 4 小时每孔加入 MTT 溶液（5 mg/ml）20 l；37 继续孵育4 小时，然后终止培养，离心、弃上清，每孔加入 150 l DMSO，充分溶解结晶物；而后选择 492 nm 波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。试验重复 3 次，取平均值。以时间为横坐标，光吸收值（OD）为纵坐标，绘制生长曲线细胞形态学检查2 mmol/L VPA 处理 HL-60 细胞 2 天，0.25 mmol/L VPA处理 HL-60 细胞 1
11、周后，分别收集细胞悬液，离心，PBS 液洗涤，甩片，常规 Wright-Giemsa 染色，光镜下观察细胞形态。NBT 还原能力测定HL-60 细胞在分化诱导剂的作用下能成熟分化。分化细胞中的过氧化物酶能使外源性的 NBT 还原成难溶性的紫色结晶物，并沉着于细胞内有酶活性的部位，显微镜下可见阳性细胞有着色斑，未分化细胞则呈 NBT 反应阳性。本试验以 0.25 mmol/L VPA 处理HL-60 细胞，37 5% CO2 培养箱继续孵育，2-3 天换液加药 1 次；1 周后收集细胞，每管加入 0.1% NBT 溶液 0.5 ml 和 TPA 200 ng，37孵育 1 小时；取细胞悬液甩片，
12、Wright-Giemsa 染色后6计数 200 个活细胞，胞质中蓝紫色沉淀者为 NBT 反应阳性细胞，计数阳性细胞百分数，试验重复 3 次，取平均值。流式细胞术 Annexin V 是一种 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。碘化丙锭（PI）是一种核酸染料，将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。正常细胞 Annexin-V（-）PI（- ） ，早期凋亡细胞 Annexin-V（+）PI（-） ，晚期凋亡细胞和坏死细胞 Annexin-V（+ ）PI（+） 。本试验用 2 mmol/
13、L VPA 处理 HL-60 细胞 24 小时，取细胞悬液各 1 ml（1106 个细胞） ，PBS 洗 2 次，离心弃上清，Annexin-V、PI避光染色 20 分钟，用 ELITE ESP 流式细胞仪（FCM Coulter 公司）检测凋亡百分比；2 mmol/L VPA 处理 HL-60 细胞 48 小时，收集细胞（2106 个细胞） ，预冷 PBS 洗 2 遍，离心弃上清后加入 1 ml PBS、2 ml 无水乙醇 4固定过夜，加入 DNA-Prepstain 染液后，同一仪器检测各组细胞的荧光强度，每份样品检测约 5 000 细胞，用 DNA multi cycle 软件（Beck
14、man Coulter）进行统计学分析，得到各组细胞周期时相。试验重复 3 次，取平均值。统计学分析应用 SPSS 10.0 处理数据，组间率的比较采用 Yates 连续校正卡方检验，=0.05 。7结 果VPA 对 HL-60 细胞生长曲线的影响实验显示 4、2、1 和 0.5 mmol/L VPA 对 HL-60 细胞均有不同程度的增殖抑制作用（图 1） 。VPA 对 HL-60 细胞分化的影响0.25 mmol/L VPA 作用 1 周后，出现核染色质浓缩，核仁消失，HL-60 细胞向中幼粒细胞、晚幼粒细胞分化，偶见杆状核和分叶核（图 2） 。经 0.25 mmol/L VPA 作用 1
15、 周后，实验组 NBT阳性率为 47%2，对照组为 21%6，两组间有显著性差异(P0.001)。VPA 对 HL-60 细胞凋亡的影响2 mmol/L VPA 作用 48 小时后，光学显微镜下观察可见：胞浆中大量空泡样改变，出现核固缩、核碎裂及凋亡小体（图 3） 。VPA for 24 hoursVPA 对 HL-60 细胞周期的影响8经 2 mmol/L VPA 处理 48 小时后， G1 期细胞由 51.1%增加至 84.6%，S 期细胞由 37.9%减低至 14.4%（P0.001） ，且出现明显的亚二倍体峰，凋亡细胞占 32.6%（图 5） 。讨 论近年来研究发现，HDAC 抑制染色
16、质结构异常调节所致的髓系分化相关基因表达，是急性髓系白血病发病的重要因素之一。已有多种 HDAC 抑制剂已经进入 I 期或 II 期临床试验，在治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤方面都有令人鼓舞的相关报道3-5 。VPA 一直以来用于癫痫的治疗，毒副作用较小。它是短链脂肪酸的一种，也属于 HDAC 抑制剂。目前，国外有研究发现 VPA 通过半胱天冬酶依赖和非依赖两种途径导致白血病细胞凋亡6 ，而对正常造血细胞没有严重毒性，有可能用于抗肿瘤治疗；同时 VPA 对 P-gp 和（或）MRP1 阳性的急性髓系白血病细胞同样存在抑制增殖和促凋亡作用1 ，所以 VPA 可能会对多药耐药细胞也有作用。另外，Kuendgen 等7单用 VPA 治疗 19 例 MDS 和继发于 MDS 的AML，其中有 8 例显效。所以 VPA 是一个具有应用前景的药物。但是，VPA 用于白血病治疗的临床试验还未见报道，而且 VPA 治疗白血病的作用机制及其临床疗效尚待进一步研究。n
