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1、食品毒理学基础,外推,毒理学实验的基本原则,在实验动物中产生的作用，可以外推与人实验动物必须暴露于高剂量成年的健康的（雄性和雌性未孕）实验动物与人的暴露途径相同,1.外来化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人,基本假设为：人是最敏感的动物物种；人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重（或体表面积）相关。,2.实验动物必须暴露于高剂量,(1)毒性试验的设计并不是为了证明化学品的安全性，而是为了表征化学品可能产生的毒作用。 (2)毒理学试验中实验模型所需的动物总是远少于处于危险中的人群。,3.成年的健康实验动物,成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物作为一般人群的代表性实验模型。幼年和老年
2、动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究 。,4.与人的暴露途径相同,毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式。,毒理学试验的局限性,实验动物和人的敏感性不同主观感觉无法表述剂量设置过大动物数量有限,毒理学试验的基本目的,受试物毒作用的表现和性质剂量-反应研究确定毒作用的靶器官确定损害的可逆性,1.受试物毒作用的表现和性质,在急性和慢性毒性试验中，观察受试物对机体的有害作用，对有害作用的观察应该是对每个实验动物进行全面的、逐项的观察和记录。发现有害作用是进行剂量-反应(效应)研究的前提。,LogDose,Biological Response,NOEL: No O
3、bservable Effect Level,NOAEL:No Observable Adverse Effect Level,LOEL: Lowest Observable Effect Level,LOAEL: Lowest Observable Adverse Effect Level,FEL: Frank Effect Level,2.剂量-反应(效应)研究,动物实验的职业道德,给予人道主义的管理和处理使痛觉和不适减少到最低程度避免不必要的使用实验动物,3R原则,替代（replacement)：应用无知觉材料代替使用活的有知觉脊椎动物减少（reduction)：在能保证获取一定数量与精
4、确度的数据信息的前提下，减少动物的使用数量。优化（refinement)：在必须使用动物时，要尽量减少非人道程序的影响范围和程度。,实验动物物种的选择,在代谢、生物化学和毒理学特征与人最接近的物种易于饲养和试验操作的物种自然寿命不太长的物种经济并易于获得的物种,经验性实验动物选择,两个物种：啮齿类、非啮齿类最常用的啮齿类是大鼠和小鼠；非啮齿类为犬豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验兔用于皮肤刺激试验和眼部刺激试验遗传毒理学用小鼠；致癌用大鼠致畸用大鼠、小鼠、兔迟发神经毒性常用母鸡,常用实验动物生理学参数,实验动物品系的选择,品系（strain):用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。遗传
5、学分类：近交系、杂交群、封闭群、近交系、突变系动物、转基因动物,近交系动物（Inbred strain animals） 又叫纯系动物。是采用同胞兄妹或亲子交配， 连续繁殖20代以上所培育出来的遗传上达到 高度一致的动物群。基因纯合程度可达99.8%。 主要指啮齿动物；可出现近亲交配衰退。 亲子交配与兄妹交配不能混用。 亲子交配时必须采用年轻的双亲同其子女交配。 较大动物纯种培育很难获得成功，因为世代间 隔较长，费用较大，所以成功率低。 禽类和兔的血缘关系达到80%以上 （相当于兄妹交配四代）时，即可称 为近交系。,1 基因位点纯合性,在人工控制下有系统地进行近亲交配，使杂合型祖代基因逐代地基
6、因分离，从而逐渐提高个体与群体的基因纯合率，在通过连续20代兄妹交配的培育之后近交系动物任何一个基因位点上的纯合概率高达986以上，品系内各个体在遗传上同属一种基因类型，因而能繁殖出完全一致的纯合子后代，并且动物群中不再携带未知的隐性基因，品系保留和表现所有的遗传性状，个体相互支配繁殖不会出现性状分离。,2 遗传组成的独特性,在一个近交品系内，所有动物个体都可追溯到其原始的一对共同祖先。但它们只是从祖先的整个基因库里获得极少部分基因，这些基因的组合构成了品系的遗传组成。近交品系内的所有个体在遗传上完全相同，具有独特的表型特征，而不同的近交系之间的差异又非常明显，由于近交系的遗传同源性，若对近交
7、品系中的某一个体进行基因分析可得知整个品系的基因类型。,3长期遗传稳定性,近交品系由于遗传组成的高度纯合性和同源性使其具有长期遗传的稳定性。,4均一性,近交品系内个体间在表型上具有均一性这是遗传同源性的结果，尤其是那些由遗传决定的生物学特征。,杂交群动物及其特点,杂交群动物：指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。例如：C57BL/6JDBA/2B6D2F1 B6为 C57BL/6J的缩写，D2 为 DBA/2的缩写。,1 具有杂交优势,杂种一代动物具行较强的生命力，对疾病的抵抗力强，寿命长，容易饲养，在很大程度亡克服了因近交繁殖引起的近交衰退现象，适合于进行各种长期慢性实验
8、。,2 遗传和表现型上的均质性,杂交群动物与一般的F1代动物不同，它虽然为杂合体，但具有与近交系相似的个体均质性，具有较高的一致性，不容易受环境因素变化的影响。,3具有杂合的遗传组成,F1代动物是杂合体同时具有两个亲本品系的基因，个体之间的基因型又是同一的，因其具有两个亲本的特点，可接受两个亲本品系的细胞、组织、器官和肿瘤移植，适用于免疫学和发育生物学等领域的研究。,封闭群动物及其特点,封闭群：一个种群在5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。封闭群又称远交群。,封闭群动物的杂合性，避免了近交衰退的出现，因此具有较强的繁殖力和生活力；封闭群动物的遗传组成具
9、有很高的杂合性；封闭群动物常因基因突变而导致动物某些方面异常,突变系概念及其特点,突变系是指正常染色体的基因发生了突变，从而具有某种特殊性状表型的各种遗传缺陷的品系。,突变系动物有助于认识生命的复杂性；突变系动物可以作为人类疾病的动物模型在基础医学和临床医学中应用。裸鼠,转基因动物,转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,实验动物按微生物分类,按微生物学控制标推或微生物净化程度，目前国际上一般将实验动物分为四个等级，即无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物和普通动物。,无菌动物,在自然界中并不存在，是在隔离器中经人工取得仔体，用无菌母体代乳或
10、人工哺乳，经净化培育得到。,无特定病原体动物,饲育在屏障或隔离系统中，通过无菌动物、悉生动物、无特定病原菌动物获得的。笼具、饲料饮水要经过特殊处理，并有严格的检疫、消毒隔离制度。,悉生动物,又称清洁动物，种系清楚，没有该动物特有的病原菌。饲养在屏障系统中，空气要经过净化、饲养室保持正压，进入室内的一切物品要经过消毒灭菌，工作人员进入要洗澡和穿灭菌工作服，动物饮灭菌水。,普通动物,是在微生物控制上要求最低的动物，饲养在开放系统，空气未净化，可饮自来水，房舍要求有通风设施，人员进入要穿工作服专用鞋帽。,实验动物设施的分类,开放系统：饲育环境与外界相同；有强力通风设施、饲料饮水和垫料要求不被污染，应
11、防鼠和防昆虫措施。屏蔽系统：洁净度万级，环境封闭，送入的空气要过滤。饲料饮水和垫料要灭菌，饲养人员要经过淋浴、穿无菌工作服，戴口罩手套。隔离系统：洁净度百级，以隔离器为主体，送入的全新风达百级以上，一切物品经严格灭菌，饲养人员不得入内。,【上海斯莱克实验动物有限责任公司】【中国科学院上海实验动物中心 】【国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心】,实验动物个体的选择,性别：一般雌雄各半，特殊？年龄和体重：急性毒性用成年，慢性用年幼或初断乳的实验动物。生理状态：避免妊娠反应，特殊？健康情况：将康 在实验前观察5-7天,实验动物的管理,动物的管理：接收、饲养、来源、鉴别等记录环境条件控制：温度、湿度、
12、通风、光照、噪音、垫料等设施管理：清洁卫生、废弃物管理等,实验动物的准备,实验动物前的准备：观察、性别辨认实验动物的抓取和固定实验动物的编号实验动物随机分组,实验样品的制备,了解样品的纯度和杂质化学结构和理化性质挥发性、溶解性、酸碱度、稳定性所需样品总量的计算总量=（A B C D) 1.2A ：每组动物数；B：各处理组的计量和C： 染毒次数： D：动物的平均体重,溶剂和助溶剂的要求,无毒或实际无毒与样品不起反应不影响样品的毒效无特殊刺激性气味遗传毒理学用小鼠；致癌用大鼠致畸用大鼠、小鼠、兔迟发神经毒性常用母鸡,制备样品制剂时的要点,加热样品时不应接近改变样品化学性质或物理性质的温度如样品为固
13、体评价其对皮肤的毒性时，应保持其形状和颗粒大小多成分的样品应按配方配制如可能，制剂pH应为5-9不应用酸或碱使样品解离如应用非胃肠道途径，终溶液尽可能接近等渗,染毒途径,静脉注射、吸入、肌内注射、腹腔注射、皮下注射、口服、皮内注射、经皮,经口染毒特点,喂饲：动物自行摄入，一般最高含量5%，营养成分可更高，不适宜于口感差，易挥发水解的样品，实际染毒量计算需单笼饲养。灌胃：操作前禁食空腹，大鼠隔夜，小鼠4个小时，均不停饮水，灌胃后2-4小时提供饲料，经口多次染毒一般不禁食。吞咽胶囊：适用于易挥发水解和有异味的样品。,操作要点,喂饲：动物自行摄入，一般5%, 一些有营养价值的事物成分可更高，但应注意
14、不要造成营养成分失衡而影响动物的生长发育。不适于口感性差的样品；易挥发或水解的样品；若要计算实际染毒量需单笼饲养。灌胃：灌胃前应禁食空腹，大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小时，均不停饮水，灌胃2-3小时后提供饲料。若经口多次染毒,经呼吸道染毒,静式吸入染毒：染毒时间一般为两小时，要求样品在10分钟内挥发完毕。动式吸入染毒：每天的染毒时间为6小时，保证氧气的浓度为19%。气管内注入：建立急性中毒模型。,注射染毒,皮下注射：注射时以左手拇指和食指提起皮肤将注射器刺入皮下，注射部位一般为大腿外侧 小腹部、背部或耳根部。皮内注射：需局部脱去背毛，消毒后用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧在两指之间紧贴皮肤表层
15、刺入皮内。肌内注射：选肌肉发达无大血管通过的部位一般为臀部，注射时垂直迅速刺入肌肉。腹腔注射：注射时左手抓住动物，腹部向上右手于左下腹部刺入皮下。静脉注射：一般采用尾静脉还有耳部，犬可采用头静脉。,染毒途径与染毒量,经口20ml/kg（对空腹动物）；经皮2ml/kg；静脉1ml/kg；肌内注射0.5ml/kg（每一部位）；每眼0.01ml/kg；吸入2mg/L;鼻孔0.1ml,生物标本采集,血液采集尿液采集胆汁采集粪便采集,血液采集,终末取血：以动物死亡为实验结束非终末取血：麻醉或清醒的实验动物身上单次或多次采血。血液总量取决于物种、性别、年龄、健康及营养状况，一般总循环血量为55-77ml/kg体重。单次取血量低于动物总血量的15%，取血量在1520%血压降低30%，3040%引起缺血性休克，40%时引起50%实验动物死亡。,单次采血不超过动物总血量的15%，可在34周后重复采血。多次采血每24h不应超过总血量的1%，取血量不超过0.1ml时，可通过尾尖取血，也可以通过眼眶取血。不赞成在无麻醉条件下取血。,尿液粪便采集,可用代谢笼下部有粪尿分离器，取粪便分析时剔去表层，取内层分析。,麻醉,麻醉分为四个时期：痛觉丧失期、兴奋期、耐受期、窒息期。痛觉丧失期：从药效开始发挥到意识丧失兴奋期：从意识丧失开始出现到规则呼吸结束，呼吸不规则，瞳孔扩大，运动反射增强，眼球震颤,
