食品分析检验 蛋白质的测定

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1、蛋白质和氨基酸的测定1 概述2 凯氏定氮法3氨基酸氮的测定,1 概述（1）食品中的蛋白质含量及测定意义（2）蛋白质系数（3）蛋白质测定方法,食品中的蛋白质含量,牛肉 猪肉 兔肉 鸡肉 20 9.5 21 20大豆 米 面粉 菠菜 苹果 40 8.5 10 2.4 0.4,食品中的蛋白质含量,(1)蛋白质的测定意义 测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有 微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区

2、别其他有机化合物的主要标志。,（2）蛋白质系数 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一 份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。,（）蛋白质的测定方法 一类是利用pro的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro含量如剀氏定氮法、双缩尿法。 另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。紫外分光光度法考马斯亮兰法、

3、福临酚试剂法 但是食品种类很多，食品中pro含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此pro的测定通常利用经典的剀氏定氮法,蛋白质的定量测定一、凯氏定氮法一些蛋白质的含氮量 一般为 15% 17.6%，有的上下浮动可以测出总氮 N,= N6.25 = 蛋白质含量,由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。,（一）常量凯氏定氮法1. 原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。整个过程分三步：消化、蒸馏、

4、吸收与滴定,（1） 消化 总反应式：,加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。,加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。,仪器：要防止爆沸。,影响氨化完全和速度的因素:（1）K氏烧瓶和取样量 1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，8001000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。（2）分解剂A H2SO4和K2S

5、O4的添加量 K2SO4和H2SO4的添加比例是： 1g样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml 这种比例在国内外都使用，是公认的还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20ml,B 催化剂 用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，TiO2的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同， HgO消化麦子为38min，Se与CuSO4消化麦子55min，TiO2消化麦子70min，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。,（3）热源的强度消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2SO4加

6、得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低（4）氨的蒸馏和吸收及滴定 水蒸汽蒸馏蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为124=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到5055ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。,吸收液有：1.标准H2SO4 用标准碱返滴定，甲基红指示剂2 .硼酸 用HCl进行滴定，混合指示剂 目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸

7、收，为保险期间一般用4%。,观察与思考：1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么变化？2、消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么？、如何判断消化的终点？,2. 蒸馏 水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 在接受瓶中加入吸收液及指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。,“以奈氏试 剂”检查氨是否全部蒸完，奈氏试剂Nessler试剂，K2（HgI4） 检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色沉淀。配制方法1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L

8、氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。,方法2、 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。,思考：1、为什么在蒸汽发生瓶中要加入批示剂甲基橙和硫酸？加入数粒玻璃珠的作用是什么,滴定用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸） 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。,. 结果计算,.说明与讨论： 所用试剂溶

9、液应用无氨蒸馏水配制。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，促进其消化完全。, 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 23 m1 后再继续加热消化。, 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引

10、起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸被过多底物消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸。, 般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 蒸馏装置不能漏气。, 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在7090时发黑。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。,(二)微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量由50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可

11、用微量滴定管。3、蒸馏装置见 159 页图 10-2 。,(三)自动凯氏定氮法1、原理及适用范围同前 2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。,产品名称： 凯氏定氮仪,二、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。,1.原理 脲（尿素）NH2CONH2 加热至150160时，两分子缩和成双

12、缩脲。,NH2CONHCONH2 + NH3,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键 CONH 与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）,2.方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定,三.Folin酚试剂法（Lowry法）1.原理 此法是双缩脲法的进一步发展。它的第一步就是双缩脲反应，即Cu+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然

13、后这个络合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(福林-酚试剂)，结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L400mg/L含量的蛋白质溶液,2.特点. 此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色。其不足之处就是此反应受多种因素干扰。在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。,3. 注意:1)加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有

14、效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。2)干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差,四.考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法1.原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。 在595nm下，光密度与蛋白质 含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。,2.考马斯亮蓝染色法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowr

15、y法约高四倍。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。,（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。,3.此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。,