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1、2017/12/25,1,超氧化物歧化酶的定向进化,指导教师：张 今教授,答辩人：苟小军,研究方向：基因工程与蛋白质工程,东北师范大学,2017/12/25,2,DNA重组技术的发展出现了基因工程，定点突变技术的出现诞生了蛋白质工程，在基因工程和蛋白质工程的基础上，DNA shuffling技术的应用，出现了分子进化工程。1999年5月12日-15日 在美国由5000多名生物技术专家参加的会议上，定向进化被认为是达尔文进化论在分子水平的体现，是一场进化革命，引起各国科学界和企业界的高度重视。在实验室中模拟几百万年来发生在自然界中的漫长的进化过程，这种思想很快的得到了实验的支持和广泛应用。,20
2、17/12/25,3,基 本 原 理,属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。定向进化的关键在于“变”和“筛”的方法。,2017/12/25,4,目前存在的问题,（1）天然酶在现存的工业条件下（例如在有机相、极端温度和pH）的稳定性较差或其催化水平很低；（2）天然酶在工程菌中的折叠效率较差或对蛋白酶敏感；（3）酶的催化范围需要扩大或减小；（4）需要创造具有新反应活性的酶；,2017/12/25,5,研 究 策 略,酶法体外随机-定位诱变；易
3、错PCR技术为代表的无性进化；DNA shuffling为代表的有性进化； 基因家族之间的同源重组；外显子改组；模块酶与杂合酶技术；细胞定向进化；,2017/12/25,6,博士期间主要从事的工作,人Cu,Zn-SOD筛选模型的建立及采用易错PCR和交错延伸技术的进化；人Cu,Zn-SOD与肝素亲和肽的杂合酶；人EC-SOD与人Cu,Zn-SOD的杂合酶。,2017/12/25,7,第一部分 人Cu,Zn-SOD筛选模型的建立及采用易错PCR和交错延伸技术的进化,2017/12/25,8,研究背景,不同来源的Cu,Zn-SOD之间具有明显的序列同源性和进化保守性；不同来源的Cu,Zn-SOD之
4、间具有结构同源性；长期的自然选择使得Cu,Zn-SOD的结构和功能趋于高度保守；,2017/12/25,9,为什么不同的Cu,Zn-SOD之间存在这样的保守性？,恒定的氧压力？！,现有的保守性是否会长期维持下去？,如果环境发生剧烈改变，该酶又将何去何从？,？,为了加深我们对这些问题的理解，通过在实验室中运用定向进化的手段模拟天然发生的过程，研究它在不同于正常氧压力下的进化行为。,2017/12/25,10,拟解决的问题：,获得合适的突变库用作进化的材料；高通量的筛选方法，能快速选择出所需要的突变体；适宜的筛选压力，指导进化的方向。,2017/12/25,11,一、突变库的建立,改进的易错PCR
5、方法：MgCl2浓度增加到7mmol/L稳定非互补的碱基对；加入0.5mmol/L MnCl2降低聚合酶的特异性；dCTP和dTTP的浓度增加到1mmol/L促进错误掺入；Taq DNA聚合酶量增加到5U以促进延伸链在碱基错配位置后得以继续。交错延伸策略；,2017/12/25,12,2017/12/25,13,目前只有在酶水平上的活力测定方法；我们获得了一株sodAsodB双缺陷菌株QC779；QC779菌株体内的O2-富集，导致二羟酸脱水酶失活，造成分枝氨基酸Val，Leu，Ile合成受阻。 QC779菌株只有获得超氧化物歧化酶活力，才能在基本培养基上生长。,二、筛选方法的确立,2017/
6、12/25,14,三、高氧压力的获得,Paraquat属于紫精类化合物，化学名为1,1-二甲基-4,4-联吡啶，其化学结构如下：,其反应可表示如下（以BP代表paraquat）：,2017/12/25,15,QC779 containing pBVSOD,Figure 2 The growth of bacteria in minimal medium,筛选方法验证,质粒图谱和蛋白质电泳结果证明，能够在基础培养基上生长的QC779菌株都含有能表达SOD的重组质粒。,2017/12/25,16,Figure 3 The growth of bacteria in paraquat(paraqua
7、t concentration: 0, 310-7, 3 10-6M),Wild-type,QC772(sodA),超氧自由基的产生者Paraquat的作用,2017/12/25,17,Figure 4 The growth of bacteria in paraquat(paraquat concentration: 0, 310-7, 3 10-6M),QC773(sodB),2017/12/25,18,Figure 5 Paraquat sensitivity of different strains in the minimal medium with paraquat concent
8、ration 3 10-7M,Paraquat是良好的筛选压力，其不同浓度对同一菌株和同一浓度对不同菌株的作用不一样。菌体内SOD发挥功能越充分，菌体耐受力越强。,2017/12/25,19,Figure 6 The scheme for the directed evolution of hCu,Zn-SOD,2017/12/25,20,实验结果,7 6 5 4 3 2 1,Figure 7 The PCR products of directed evolution,2017/12/25,21,细胞水平,筛选结果的讨论：,Figure 8 The bacteria growth in mi
9、nimal medium with paraquat at 510-6M,QC779(hCu,Zn-SOD mutant),QC779(hCu,Zn-SOD wild-type),2017/12/25,22,Figure 9 The bacteria growth in rich medium,2017/12/25,23,基因水平,1、通过顺序分析，突变体具有四个点突变：Phe45(TTCTTT)Val87(GTGGTA)Glu133Gln(GAACAA)Ala140Gly(GCTGGT)2、前两个同义突变的密码子在大肠杆菌中使用频率增加；3、Ala140Gly可能增加折叠的含量；4、Glu1
10、33Gln直接影响负电底物向活性中心的扩散。,2017/12/25,24,酶水平,Figure 10 Identification of the purified native and mutant Cu,Zn-SODLane 1 human Cu,Zn-SOD(wild type); Lane 2 Molecular weight marker, Lane 3 human Cu,Zn-SOD (mutant);,1 2 3,2017/12/25,25,野生型的活力为1140U/mg蛋白，而突变体的活力1280U/mg蛋白；常氧压力下酶活力没有明显差别；高氧压力下突变体具有明显的生长优势；原因
11、主要有两个：1、测定时与生理状态pH值不一样；2、测定状态与高氧压力时底物浓度不一样。,2017/12/25,26,小 结,我们成功建立了SOD的高效筛选模型 ；环境是影响进化结果的一个重要因素，这或许是我们在正常的氧压力下选择不到优势突变体的一个原因 。,2017/12/25,27,第二部分 人Cu,Zn-SOD与肝素亲合肽的杂合酶研究,2017/12/25,28,人Cu,Zn-SOD基本性质；人Cu,Zn-SOD负责催化： E-Cu(II) + O.2 E-Cu(I) + O2 E-Cu(I) + 2H+ + O.2 H2O2人Cu,Zn-SOD的临床应用：治疗自身免疫性疾病；治疗心肌缺血
12、与缺血再灌流综合症； 治疗某些心血管疾病； 抗衰老的研究；,研究背景,2017/12/25,29,天然SOD作为药用酶用于临床受多种因素的影响:(1)半衰期短，在体内停留时间通常只有6-10分钟；(2)分子量在32000左右，不易透过细胞膜；(3)如果口服，易受蛋白酶水解而失去活性；(4)体内特异等。 为解决上述不利因素，国内外主要用分子工程方法对SOD进行分子修饰，或做成脂质体。,面临的问题,2017/12/25,30,HEC-SOD的发现为我们提供了一种新思路：,HEC-SOD是一种四亚基糖蛋白，分子量约为130KD； C-末端含有肝素亲合区，富含碱性氨基酸； 肝素亲合性赋予HEC-SOD
13、半衰期明显长于hCu,Zn-SOD，约为10小时；,可以将肝素亲合特性赋予hCu,Zn-SOD以获得长半衰期的hCu,Zn-SOD。,2017/12/25,31,RT-PCR扩增HCu,Zn-SOD基因；构建含肝素亲和肽的重组质粒；表达与纯化；部分理化性质测定。,研究方案,2017/12/25,32,肝素亲和肽重组质粒的构建,2017/12/25,33,Figure 11 Strategy of the construction of the recombinant,2017/12/25,34,Figure 12 Strategy of selection of the recombinant
14、 plasmid,提高克隆效率,2017/12/25,35,1 2 3 4,Figure 13 SDS-PAGE analysis of the protein expressionLane2 E. coli DH5(pBVSOD); Lane3 E. coli DH5(pBVHBSOD);,2017/12/25,36,Table 1 The Results of Purification,2017/12/25,37,1,2,0,.,0,0,Figure 14 The optimum pH of SOD and HBSODClosed circles: HBSOD; Opened circle
15、s: SOD,理化性质,2017/12/25,38,I,n,c,u,b,a,t,i,o,n,t,i,m,e,(,m,i,n,),Figure 15 Heat stability of SODClosed circles: HBSOD; Open circles: native SOD,2017/12/25,39,Figure 16 heparin-agarose chromatograph of HBSOD.the enzyme eluted at a concentration of approx 0.4M NaCl,2017/12/25,40,Figure 17 The hCu,Zn-SO
16、D and the HBSOD titration curve of pHThe pI of Cu,Zn-SOD is 5.5; The pI of HBSOD is 7.5;,2017/12/25,41,Figure 18 The second structure of human Cu,Zn-SOD(A) and the HBSOD(B),A,B,2017/12/25,42,Figure 19 The second structure percentage of human Cu,Zn-SOD(A) and the HBSOD(B),A,B,2017/12/25,43,小 结,采用RT-PCR的方法从人胎肝组织中钓取到了人铜锌超氧化物歧酶的cDNA片段，建立了一种提高克隆效率的方法；构建了人铜锌超氧化物歧化酶的高效表达载体pBVSOD并成功地在细菌中得到了表达和纯化；构建了对肝素有亲和性的人铜锌超氧化物歧酶的表达载体pBVHBSOD并在细菌中得到了表达和纯化，研究了此酶的最适pH值、热稳定性、肝素亲和性并进行了相应的分析。,
