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1、1Y 染色体微缺失与男性不育相关作者：刘芳陈必良苏明权王德堂 【关键词】 不育 关键词: 不育，男（雄）性;Y 染色体;染色体缺失;基因 摘 要:目的 探讨 Y 染色体微缺失与原因不明性无精症、少精症所致男性不育的相关性. 方法 特发性少精症 18 例、特发性严重少精症 12 例、特发性无精症 5 例及正常已生育健康男性 10 例作为研究对象和正常对照.应用多重 PCR 技术，对精液基因组 DNA 进行 Y染色体上连续的 18 个序列标记位点检测. 结果 少精症 18 例中发现Y 染色体微缺失 2 例，严重少精症 12 例中发现 Y 染色体微缺失 3例. 无精症 5 例和正常已生育男性 10
2、例均末发现 Y 染色体微缺失.缺失形式 3 种. 结论 Y 染色体微缺失与精子发生障碍相关. Keywords:infertility，male;Y chromosome;chromosome deletion;genes Abstract:AIM To evaluate the microdeletion of Y chromo-some in infertile men with idiopathic azoospermia and oligozoospermia.METHODS 18patients with idiopathic a-zoospermia，12with severe i
3、diopathic oligozoospermia 2and5with idiopathic oligozoospermia were selected for analysis.10normal fertile males were used as the control.Multiple poly-merase chain reaction was performed to detect microdeletin of Y chromosome in genomic DNA of semen，and a series of18sequencetagged sites（STSs ）mappe
4、d within Y chromosome were selected.RESULTS Y chromosome microdeletion was observed in2of the18males with oligozoospermia，and in3of the12males with severe oligozoospermia.No such dele-tion was observed in5azoospermic males and10normal fer-tile men.The3patterns of microdeletion were identified.CONCLU
5、SION Y chromosome microdeletion might be closely related to spermatogenic failure. 0 引言 全世界约 15%的夫妇不育，男性不育占 50%左右，其中 60%以上精子发生减少的原因不清，认为有遗传变异存在1 .近来发现Y 染色体微缺失，主要是 AZF 基因缺失与之有关.我们采用多重 PCR技术，对 45 例研究对象精液基因组 DNA 进行 Y 染色体微缺失检测，旨在从分子水平对男性不育病因作一些探索. 1 对象和方法 31.1 对象 2001-03/2001-11 西京医院妇产科不孕不育专科门诊患者 35 例.其
6、中特发性少精症 18 例，特发性严重少精症 12 例，特发性无精症 5 例.平均年龄 33（2639）岁，婚后不育年限1.58（平均 3.5）a.所有患者性功能正常，无生殖系统器质性病变及炎症、阻塞等.10 例正常对照精液标本为西京医院妇产科实验室储存，平均年龄 27.5（2235）岁. 所有研究对象在检测前抽静脉血检查染色体核型（G 显带技术） 、抗精子抗体（ELISA ）及血清激素水平（卵泡刺激素、黄体激素、睾酮，放射免疫测定法） ，异常者均不列入研究对象. 1.2 方法 精子密度判断根据 1992 年 WHO 标准制定，采用北京伟力经贸公司 WLKY-9000 伟力彩色精子质量检测系统进
7、行检测. 研究对象禁性生活 3d 后，取精液检查，连续 2 次异常予以确诊.无精症:精液中未见精子; 严重少精症:精子密度小于 5109 L-1 ;少精症 :精子密度（520）109 L-1 .精液基因组 DNA 提取采取氛氯仿抽提法. 精液标本离心弃上清，生理盐水洗涤后，加入细胞稀释悬浮液、10gL-1 SDS， 3molL -1 氯化钠、双蒸水和酚氯仿（VVV25241） ，离心取上层，加无水乙醇离心，75mLL-1 乙醇洗涤，双蒸水溶解DNA.紫外分光光度计及 20gL-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定其4纯度及含量.提取的 DNA 置-20 保存. 缺失筛查采用美国 Promega公司生产的 Y
8、 染色体缺失检测系统（Y chromosome Deletion Detection System，Versisn1.1Part#TM234） ，其包含有 Y 染色体上与精子生成基因最相关的 18 个已知序列标记位点引物对 .同时扩增 18 个非多态序列标记位点短 DNA 片段（分别位于 AZFa AZFb AZFc AZFd 区域，Fig1）.扩增产物长度为 83370bp，琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色观察.试剂盒提供对照梯度标准物.检测系统分 A，B，C，D4 组反应液，每组内均有一对照引物扩增 X 连锁的 SMCX 位点，以作为扩增反应效果和 DNA 完整性对照.另外设正常男性 DNA
9、阳性对照及空白阴性对照.如果测试样品不能扩增出 Y 染色体特定区域，则意味着测试样品 Y 染色体有该区域微缺失. 初筛异常标本经 23 次 PCR 重复检测证实.PCR 总反应体积25L，循环条件 :942min，941min， 5730s，721min，35 个循环，最后 72延伸 5min，4保温. 扩增产物在20gL-1 琼脂糖凝胶，1TBE 缓冲液及5Vcm-1 电流条件下电泳.经 UV-150 紫外线透射分析仪照射后，复日科技 FR-2000 紫外与分析可见装置扫描成像. 2 结果 35 例异常精液标本除 5 例无精子症外，余 30 例少精症中28 例伴有精子活率低下，精子活率范围
10、3.0%46.6%，平均525.3%.10 例对照男性其精子数量及活率正常.所有精液标本采用氛氯仿抽提法提出了精液基因组 DNA，经多重 PCR 扩增，电泳显示特异性 SMCX 带（83bp） ，示多重 PCR 扩增反应有效，提取的DNA 具有完整性 .35 例患者精液基因组 DNA 经多重 PCR 扩增检测后发现 5 例有 Y 染色体微缺失，缺失率 14.3%，其中 2 例为少精症，3 例为严重少精症.5 例无精症患者和 10 例对照男性未发现 Y 染色体微缺失.缺失表现形式 3 种:1 例 AZFc（DAZ+SY157 ）+AZFb（SY130+SY128 ）缺失;1 例 AZFc（DAZ
11、+SY157 ）+AZFd（SY152）缺失;余 3 例均为 AZFc 缺失（Fig1，Tab1）.5例缺失患者均有 AZFc 缺失，无 AZFa 缺失，亦无 AZFb 和 AZFd单独缺失.AZFc 缺失片段各不相同，但包含有共同缺失片段DAZ（SY254 ，SY255，Fig1 ，2）. 图 1 略 表 1 Y 染色体微缺失患者缺失部位、片段及精子密度、活率略 3 讨论 我们发现 35 例不明原因性无、少精症患者中有 5 例显示 Y染色体微缺失，10 例正常对照无一例发现微缺失，提示 Y 染色体微缺失与男性精子发生相关.Y 染色体微缺失发生率报道不一2，3 .Foresta 等4 分析不育
12、男性 4800 例 Y 染色体基因微缺失，发6现无精症男性缺失率最高，其次是严重少精症和少精症.我们的结果只发现严重少精症缺失率高于少精症，5 例无精症患者无一例发现微缺失，与无精症患者样本量少可能有关.我们研究表明，缺失最多的部位亦为 AZFc 区中的 DAZ 基因，且所有 DAZ 基因缺失患者均有共同缺失片段:DAZ 基因簇中的 SY255 和 SY254，提示此两基因参与精子的发生. 图 2 略 关于 Y 染色体微缺失的机制说法不一，主要认为:Y 染色体在精子发生过程中，由于胚细胞快速分裂，与卵子发生过程相比具有更多突变机会;Y 染色体不能象常染色体一样进行 DNA 修复;所有 Y 染色
13、体基因都是单倍体，故一个基因缺失就能发生效应3 .但也有学者持相反观点:认为 Y 染色体微缺失形成是一种随机事件，不依赖于 Y 染色体出现的背景，可能是其它遗传或环境因素所致，Y 染色体微缺失是导致男性无、少精症的重要原因. 参考文献: 1Krausz C，McElreavey K.Y chromosome and male infertility J.Front Biosci，1999;15（4）:l-8. 2Maurer B，Gromoll J，Simoni M，Nieschlag E.Prevalence of Y chromosome microdeletions in inferti
14、le 7men who consulted a ter-tiary care medical centre:The Munsteer experience J .An-drologia，2001;33（1）:27-33. 3Hiroshi Kato，Shinji Komori， Yuko Nakata.Screening for dele-tions in interval D1622of the Y chromosome in azoospermic and oligozoospermic Japanese men J.Hum Genet，2001;46 （3）:110-114. 4Foresta C，Moro E，Ferlin A.Y chromosome microdeletions and alteration of spermatogenesis J.Endocr Rev，2001;22（2 ）:226-239.
