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1、苹果酸乳酸发酵的研究进展 3潘海燕 徐 岩 赵光鳌(江南大学生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室 ,无锡 ,214036)摘 要 苹果酸乳酸发酵是现代葡萄酒、苹果酒酿造工艺中非常重要的二次发酵过程。葡萄酒、苹果酒经过苹果酸乳酸发酵以后 ,原有的酸涩和粗糙感降低 ,而变得柔和、圆润且具有果香味。文中根据国内外研究成果 ,分析总结了苹果酸乳酸发酵的机理并且对苹果酒酿造过程中乳酸菌的一些生长特性进行了阐述。在此基础上 ,论述了现代生物技术在苹果酒和葡萄酒生产中的新应用。关键词 苹果酸乳酸发酵 ,机理 ,乳酸菌 ,进展第一作者 :硕士研究生 (徐岩为通讯作者 ) 。3 国家“十五”科技攻关资助项目
2、 (No12001BA501AOF)收稿时间 :2003 - 05 - 26苹果酸乳酸发酵 ( malolactic fermenta2tion ,简称 ML F) 是葡萄酒、苹果酒酿造中非常重要的二次发酵过程。在葡萄酒的酿造过程中 ,苹果酸乳酸发酵不仅可降低生葡萄酒的酸涩和粗糙感 ,使之柔和、圆润 ,而且还提高了葡萄酒的感官质量和生物稳定性 ,所以许多优质红葡萄酒甚至一些佐餐红葡萄酒都要进行苹果酸乳酸发酵 1 。北方地区气候寒冷 ,苹果酸度较高 ,酿造出的苹果酒口感较酸涩 ,需要进行苹果酸乳酸发酵来改善其风味。相反 ,南方地区苹果酸度较低 ,有些酿酒师并不提倡进行苹果酸乳酸发酵 ,所以目前更
3、多的酿酒师考虑的是苹果酸乳酸发酵对葡萄酒、苹果酒风味的贡献 2 。近年来 ,国外主要集中在 (1) 发酵剂的研发 ; (2) 细胞固定化以及酶反应器的开发与应用 ; (3)分子生物学角度研究苹果酸乳酸酶。对于苹果酒的酿造 ,目前国内采用的苹果品种主要是红富士 ,酸度处于中等水平 ,所以根据我国苹果品种的特点 ,不能让苹果酸乳酸发酵仅仅停留在降酸的层次上 ,更多的应考虑苹果酸乳酸发酵对风味的改善。 2000 年 ,苹果酒的研究开发已被列入国家的“十五”攻关项目 ,苹果酸乳酸发酵作为苹果酒酿造中一个重要环节 ,需要得到广泛的、深入的研究。1 苹果酸乳酸发酵的机理111 苹果酸乳酸发酵的途径苹果酸乳
4、酸发酵是在酒精发酵结束以后 ,在乳酸菌的作用下 ,将 L2苹果酸 (二元酸 ) 转化为 L2乳酸 (一元酸 ) 和 CO2 的过程。关于苹果酸乳酸发酵的机理 ,Revel 等认为此过程经过丙酮酸途径 ,此途径有 2 种不同的方式 ,如图 1 (A ,B) 所示。途径 A 需要 3 种酶 ,即苹果酸脱氢酶 ( MDH) 、草酰乙酸脱羧酶 (OADC) 和乳酸脱氢酶 (LDH) ;途径 B 需要苹果酸酶和 LDH。但是目前的观点认为该途径是在 Mn2 + 、苹果酸 2乳酸酶 (ML E) 存在的情况下 ,直接将 L2苹果酸转化为 L2乳酸 ,如图 2 所示 。由于乳酸菌具有 L2和 D2LDH 2
5、 种酶 ,所以按照图 1 ,丙酮酸途径产生的是 L2乳酸和 D2乳酸 2 种 ,而葡萄酒的苹果酸乳酸发酵只产生 L2乳酸 ,这个结果推翻了苹果酸乳酸发酵经过丙酮酸途径 3 。此外 ,继 Lonvaud 从肠膜明串珠菌中分离纯化得到苹果酸乳酸酶之后 ,越来越多的研究者从不同的乳酸菌中分离得到苹果酸乳酸酶并且分析了该酶的酶学特性 ,这些都更加证明了苹果酸乳酸发酵是按照图 2 所示的途径进行的 4 。57第 29 卷 第 11 期 潘海燕等 :苹果酸乳酸发酵的研究进展综述与专题评论 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All righ
6、ts reserved.图 1 苹果酸乳酸转化的可能途径图 2 苹果酸乳酸发酵的代谢模式112 乳酸菌生长的生理特性关于苹果酸乳酸发酵 ,早期有些研究人员认为该过程只有微生物的作用和 CO2 的释放 ,仅是一个简单的酶促反应 ,没有底物水平磷酸化 ,因此 ,这个过程不产生能量 ,不是严格意义上的发酵 5 。然而 ,Loubiere 等人的研究表明 ,ML F 过程中苹果酸确实能够刺激细菌的比生长速率 ,增加细菌生物量 6 。研究者普遍认为虽然苹果酸乳酸转化本身不能给菌体提供能量 ,但是在一个酸性的环境中 (例如酒 ) ,苹果酸的脱羧导致了 p H 的升高 ,这就有利于乳酸菌的生长。不仅如此 ,
7、近期的研究也表明在酸性环境里 ,苹果酸乳酸转化诱导产生 A TP ,而 A TP 的产生又是根据“化学渗透机制”进行的。苹果酸从胞外运转到胞内后 ,脱羧生成乳酸和 CO2 ,因此苹果酸乳酸转化过程中产生的能量应与上述三者的跨膜运输有关。研究发现 ,苹果酸是以酸根负离子的形式进入胞内的 ,这样在转化时胞内消耗质子 ,从而形成了质子移动力 (pro2ton motive force , P) , P 促使 A TPase 合成A TP ,就解释了为什么在酸性环境下乳酸菌能够得到增殖 6 ,7 。2 苹果酸乳酸发酵生产中的乳酸菌211 葡萄酒 、苹果酒中常见的乳酸菌引起苹果酸乳酸发酵的乳酸菌主要是通
8、过将苹果酸转化为乳酸而改善葡萄酒、苹果酒的质量。从葡萄酒、苹果酒中分离得到的乳酸菌大致相同 ,如表 1 所示。这些乳酸菌存在着 2 种不同的类型 ,一类可以正常得引发苹果酸乳酸发酵 ;一类则可以使葡萄酒败坏 ,它们主要在酸度较低条件下活动 ,分解糖的能力比分解葡萄酒中其他成分的能力强 ,从而引起挥发酸显著升高 8 。根据这一点 ,Lonvaud2Funel 建议在酒精发酵结束以后接种乳酸菌发酵剂 ,这类发酵剂主要是前一类型的乳酸菌 ,可以正常触发苹果酸乳酸发酵 ,避免细菌的糖代谢引起的葡萄酒挥发酸升高 7 。67食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries
9、Vol129 No111综述与专题评论 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.表 1 葡萄酒和苹果酒中发现的乳酸菌葡萄酒乳酸菌名称 拉丁菌名苹果酒乳酸菌名称 拉丁菌名啤酒片球菌 Pediococcus cerevisiae 啤酒片球菌 Pediococcus cerevisiae灰色明串珠菌 Leuconostoc gracile 肠膜明串珠菌 Leuconostoc mesenteroi des葡萄酒明串珠菌 Leuconostoc oenos 葡萄酒明串珠菌 Leuconostoc oe
10、nos植物乳杆菌 L actobacill us plantarum 植物乳杆菌 L actobacill us plantarum干酪乳杆菌 L actobacill us casei 干酪乳杆菌 L actobacill us casei链杆菌 St reptobacteri um 混淆乳杆菌 L actobacill us colli noi des希氏乳杆菌 L actobacill us hilgardis 苹果酸乳杆菌 L actobacill us mali食果糖乳杆菌 L actobacill us f ructivorans德斯乳杆菌 L actobacill us desi
11、 diosus短乳杆菌 L actobacill us brevis212 乳酸菌在实际生产的应用实际的葡萄酒和苹果酒生产中 ,苹果酸乳酸发酵很难得到很好的控制。由于自发的苹果酸乳酸发酵在触发和发酵时间上的不确定 ,所以在现代化的酿酒厂 ,大都采用直接添加乳酸菌来触发苹果酸乳酸发酵。采用这种方式不仅可以在短时间内结束苹果酸乳酸发酵 ,并能通过乳酸菌形成的特定的风味物质来控制苹果酸乳酸发酵的质量 ,使口感柔和、增加果香和香气的复杂性。从 1972 年 Pi2lone 和 Kunkee 开始这方面研究以来 ,已有大量的商品化酒明串珠菌发酵剂。之所以只采用明串珠菌作为发酵剂 ,是因为 Nelssen
12、 等从经过 ML F 的法、意等欧洲国家的葡萄酒中分离出的乳酸菌中 ,有 77 %属于明串珠菌属 9 。此外 ,由于明串珠菌能够耐低 p H 和高的酒精浓度 ,因此无论是在自然发酵或人工接种进行的 ML F 中 ,它均为常见菌株。研究表明葡萄酒最佳风味是经过了由 L eu2conostoc oenos 参与的苹果酸乳酸发酵后而得到的 ,而大多数足球菌属、乳杆菌属能产生不好的苦感、鼠臭味和粘稠等缺陷 ,这是选择明串珠菌作为发酵剂又一理由。但是 ,Simona 等在研究中发现在明串珠表 2 4 种不同发酵剂的优缺点种类 优点 缺点液体培养发酵剂 活性高 ,适应力强 保存时间短 (冰箱保存 2 周
13、)冷冻干燥发酵剂 保存时间较长 (1 年 ) ,不用复水和再生可直接加到葡萄酒中进行发酵 不能在恶劣环境下生长繁殖 (如低 p H、高酒精度等 )冷冻浓缩发酵剂 保存时间最长 一旦融化必须复活 ,不能重新冷冻复合发酵剂 更好的适应葡萄酒中环境 ,对噬菌体有抵抗能力 每一个起始物培养基和葡萄酒都要选择特定的菌株菌属中有 60 %的菌株能产生组胺、腐胺等物质 ,这和先前认为明串珠菌属大都不产胺类物质的观点是不一致的 ,鉴于酒中胺类物质不利于人们的健康 ,所以人们在选择发酵剂的时候应该把是否产胺作为一个指标 10 。发酵剂的类型可分为液体培养发酵剂、冷冻干燥发酵剂、冷冻浓缩发酵剂和复合发酵剂4 种
14、,其特点如表 2 ,国外大都采用冷冻干燥发酵剂进行人工诱导 ML F ,这为简化接种操作开辟了一个新的途径。目前对发酵剂的选择一般只考虑它对苹果酸转化的效率 ,对它在风味方面的贡献没有考虑。有研究表明 :ML F 对风味的改善是菌种特异性的 ,因此 ,在选择发酵剂进行苹果酸乳酸发酵的时候 ,不仅要考虑转化的效率 ,还要结合它的风味的影响 11 。213 发酵条件对乳酸菌生长的影响21311 酒精浓度Vaillant 等人在研究了 3 株明串珠菌 (2株商品菌株 B1 和 B16 , 一株实验室菌株77第 29 卷 第 11 期 潘海燕等 :苹果酸乳酸发酵的研究进展综述与专题评论 1995-20
15、04 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.13A1)对 ML F 的影响之后 ,得出在理化因素当中 ,酒精度是抑制 ML F 的最重要因素 ,其次是 p H 和 SO2 12 。目前国内苹果酒的酒精度大概是 12 ,所以筛选得到耐高酒精度的菌株对于进行苹果酒苹果酸乳酸发酵是很有帮助的。21312 SO2 含量虽然 SO2 对乳酸菌有强烈的抑制作用 ,但是在苹果酒、葡萄酒酿造中不可避免的要加入它来防止褐变。 Fang 和 Dalmasso 发现在低 p H 值 (p H314) 时 SO2 的抑制作用比高p H
16、 值 (p H318)更为明显 13 。所以苹果汁中的 SO2 添加量与 p H 存在以下关系 ,如下表 :表 3 苹果汁中 SO2 含量与 pH值的关系p H SO2 的添加量 / mg L - 1310 313 75313 315 100315 318 15021313 p H 值乳酸菌生长的最佳 p H 是 515 左右 ,p H值越低 ,乳酸菌的生长得到限制 ,苹果酸乳酸发酵也就越慢。从表 4 可以看出 :p H 大于314 后容易发生苹果酸乳酸发酵 ,但 p H 低于311 时 ,则不能正常进行苹果酸乳酸发酵。21314 温 度温度是影响苹果酸乳酸发酵的又一个重要因素。 Herrero 等在经过对不同的工艺进行研究以后 ,发现在苹果酒酿造中 ,不论采用同时发酵 (酒精发酵和苹果酸乳酸发酵同时进行 ) ,
