湿热灭菌的微生物学验证

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1、11湿热灭菌工艺的微生物学验证主讲人： 崔强2007年 8月E-mail: 2概念与方式 基础概念 灭菌工艺 无菌 药品达到无菌要求的两种方式 无菌生产工艺 最终灭菌3两种方式的比较 无菌生产工艺的局限 通常的无菌保证水平 (10-3至 10-6) 影响因素多 最终灭菌工艺的优点 赋予产品更高的无菌保证水平 生产中可变素少，出现偏差的概率低 几乎能杀灭产品中的所有微生物4制药工业常用的灭 /除菌方式 热力灭菌 湿热灭菌 (118-134oC) 蒸汽、过热水 干热灭菌 (160-320oC) 热空气 气体灭菌 环氧乙烷 离子幅射灭菌 幅射或电子束幅射 过滤除菌法 过滤名义孔径 0.9); 该线的

2、斜率的负倒数即为某微生物在特定介质内的 Z值 .40灭菌率的概念灭菌率 (L值 )系指在某温度下灭菌 1分钟所相应的标准灭菌时间 (分钟 )，即 F0和 FT的比值 (L F0/FT)。当 Z 10时，不同温度下的 L值是不同的。有关公式41致死率表0.0320.0230.0160.0100.0061030.4640.4330.3980.3590.3161170.1210.1000.0790.0600.0421101.2121.2331.2591.2921.3341221.0001.0001.0001.0001.0001210.0460.0350.0250.0170.0101050.0180.

3、0120.0080.0050.00210012111098Z值42Z 值测定与计算示例均值111 11.0 11.0 11.1 11.0116 2.7 2.8 2.7 2.7121 0.9 0.9 0.8 0.9温度()D值 (分钟)实测值梭状芽孢杆菌孢子在脂肪乳剂注射液 (20%)中的 D值843y=-0.1086x+13.069R2=0.9933-0.200.20.40.60.811.2110 115 120 125温度 oCLogDZ 值测定与计算示例（续）不同温度下梭状芽孢杆菌在 20%脂肪乳中的 D值120.5Z = - 1/(-0.1086) = 9.2 oC44D 值与 Z 值的

4、相互关系= 10(T 121.1)/Z = LD121.1DT设 T2= 121.1 oC切记：只有在特定的试验条件下， D值和 Z值才是有意义的参数log D2 log D1T1 T2Z = 45商购生物指示剂的确认1. 进行形态学和纯度确认 (至少鉴别至菌属 )2. 芽孢计数复核3. D值复核 (视实验室能力而定 )- 蒸汽灭菌工艺用 BI， 95-100下暴热预处理 15 分钟- 环氧乙烷和干热灭菌工艺用 BI， 80-85下暴热预处理 10 分钟- 预处理后迅速转移至冰水浴内- 合格标准： Log(实测值 )在 0.3-1.48Log(标示值 )之间46F0的定义及其意义F0是指在某特

5、定温度下所产生的灭菌效果与在 121.1oC下相等效时所需要的灭菌时间（分钟）。47F0的定义及其意义 (续 ) F0 是指在某特定温度下所产生的灭菌效果与在 121oC下相等效时所需要的灭菌时间 (分钟 )。 121.1 oC 或 250 oF表示 100 KPa 饱和蒸汽的温度 , 为标准灭菌温度； F 0值用于评价热（湿 /干热）灭菌工艺的对微生物的杀灭效果 . F0值可用来比较不同温度下的灭菌效果 F0值既可用生物学方法测定，也可用数学方法积分测得（积分时务必采用 121.1 oC, 因为每相差 0.1 oC, F0将会产生 2.4%的偏差 ）F0 = D121.1 ( logN0 -

6、logNt) F0= 10(T 121.1)/Zdttnt048药典对 F0 的要求 BP 1993 蒸汽灭菌程序赋予产品的 F0值不得低于 8分钟 制定依据 : 多数嗜温性细菌芽孢在 121.1 oC下的 D值在 30秒至 1分钟之间 . USP 26 蒸汽灭菌过度杀灭程序赋予产品的 F0值不得低于 12分钟 . 目标 : 使在 121.1 oC下 D值为 1分钟的细菌芽孢下降12个对数单位 (双倍于无菌保证值 ). 可采用其它灭菌程序，但要保证符合无菌标准 EP 2000、 CP 2000 蒸汽灭菌程序通常应为在 121 oC下灭菌 15分钟 可采用其它灭菌程序，但要保证符合无菌标准949

7、F0与 FT的 相互关系F0 = D121.1 ( logN0 -logNt)FT = DT ( logN0 - logNt)F0= 10(T 121.1)/Zdttnt0F0FTD121.1DT= 10(T 121.1)/Z = L=(灭菌率 )50F0值与其它温度间的等效时间示例154.5848.8824.5012.276.153.881.54103.0532.5916.348.184.102.581.03110115118121124126130F0=12分的等效时间F0=8分的等效时间温度工艺条件赋予嗜热脂肪芽孢杆菌 (D121.1=1.5分、 Z值为 10oC) F0=8分及 12分

8、时算出的等效温度与时间组合51生物指示剂验证 - 过度杀灭工艺 选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的生物指示剂（ B. stearothermophilus ATCC 7953 被视为标准菌株 D121.1= 1.5分，单位数量 105106个孢子 ） 生物指示剂与温度探头并列在同一部位 (10-20支 ) 按规定条件培养生物指示剂，如 嗜热脂肪芽孢杆菌 的培养温度为 55-60oC，培养 7天，每天检查。 对生物指示剂用培养基进行促生长检查 进行阳性对照试验 所有经受挑战试验的样品均呈阴性52生物指示剂验证 非过度杀灭工艺 选择与灭菌条件（工艺、对象及程序）相适应的生物指示剂 生物指示

9、剂的耐热性 不得低于孢子在相应产品中的耐热性 不得低于产品中污染菌的耐热性 用于每次挑战试验的所有 BI批号必须相同 . 生物指示剂的接种量计算F0 = D121.1 ( logN0 - logNt)53生物指示剂的接种量计算计算方法：F0 = D121.1 ( logN0 - logNt) Nt= 2.303log(n/q) n:每次挑战试验用生物指示剂数量q:挑战试验后呈阴性的BI数量.如果全都是阴性,则假定 q = n-1用于计算 NtF0分钟76543210-1-2-3-4-5-6t考虑要素 :1. 灭菌标准 SAL = 62. 产品 Bioburden =孢子在产品溶液中的耐热性 孢

10、子的耐热性在标准溶液中比较稳定 孢子在标准溶液中的耐热性资料 标准溶液更方便于制备和检测 适用于替代灭菌程序相近的不同产品的灭菌工艺验证 生物指示剂的 D值测定方法1055D值测定仪器Biological IndicatorEvaluator Resistometer(简称 BIER/Vessel)油浴装置 用于残存曲线法56D值测定仪器的典型温度曲线p1351301251201151101051009590.5 1 1.51210C温度时间 (分钟 )57残存曲线法测定 D值仪器及材料 油浴（适宜的温度范围，精度，容量） 毛细管与支架试验用芽孢悬浮液准备 工作悬浮液占试验悬浮液比例不超过 1

11、0% 每 0.05ml试验悬浮液中中的芽孢为 106- 108确定试验参数数据分析 线性回归和相关系数要求Y = mX + b， m=(Y X - XY)/(X X- X2) = m X/ Y58产品灭菌前含菌量控制限度CFU/瓶污染菌耐热性限度温度时间 F0控制范围（分）验证用孢子在其中的耐热性D121A1000 11725 9 -13 0.8 分B100 DC DBI11720 8.5 - 12 0.9 分C1000 DC DBI11820 9 13 0.7 分非过度灭菌程序生物指示剂验证实践案例：某公司生产三种大输液产品 A、 B和 C ，与微生物相关的基本参数如下表，请您根据这些参数设

12、计出对上述产品灭菌程序进行生物指示剂验证的方案。DC DBI59非过度灭菌程序生物指示剂验证实践可选择产品 B代表上述三产品进行验证 生物指示剂在其中的耐热性最高，而灭菌程序的F0值的下限低于其它二产品 但验证时要以 1000CFU/瓶作为污染菌含量 通过试验证明灭菌程序能使生物指示剂至少下降 9个对数单位 , 所需 F0为 D121 log = 8.1分 最低 F0满足要求60非过度灭菌程序生物指示剂验证实践? 确定验证用芽孢在每瓶产品 B中的接种数量F0 = D121.1 ( logN0 - logNt)Nt= 2.303log(n/q)n:每次挑战试验用生物指示剂数量q:挑战试验后呈阴性

13、的BI数量.如果全都是阴性,则假定 q = n-1用于计算 Nt结果：每瓶产品 B中的生物指示剂接种量要达到1.2 109CFU1161用替代性产品 (标准溶液 )进行验证 选择替代性溶液，解决接种量过高的难题 . 设生物指示剂在 PBS溶液中的耐热性 D121=1.4分 , 那么 , 所需接种量可计算如下 :F0 = Dbi (lgA - lgB)根据阴性分数法， B = 2.303 log(n/q) n为验证试验瓶总数， q为试验结果呈阴性的瓶数。假如所有的 20只试验瓶无菌检查结果均呈阴性，在计算时可假定只有 19瓶呈 阴性，那么， B = 2.303 lg(20/19) = 0.051

14、3，于是，lgB = -1.29，lgA = F0/ Dbi+ lgB = 8.1/1.4 - 1.29 = 4.5, A = 104.5个菌 /瓶因此，每个挑战瓶内的孢子接种量可控制在 5-10 104个。62非过度杀灭程序的日常监控批产品灭菌前含菌量控制与监测 建立控制指标，通过相应的控制措施来实现 对批产品进行监控 样品对批产品应具有代表性（灌装前中后取样） 总需氧菌含量（薄膜过滤法） 污染菌的耐热性（沸水浴处理 + 过滤 + TGB培养） 一旦污染菌的耐热性超过 BI耐热性，则需用污染菌对工艺进行验证，验证合格后，相关产品方可放行。63参数放行的基本概念什么是参数放行 参数放行系指根据

15、对经过验证的灭菌工艺进行有效的控制、监测和相关文档资料，来代替对最终灭菌产品进行无菌检查的无菌评价放行程序。实行参数放行的意义 灭菌工艺验证的自然结果 克服成品无菌检查的统计学局限性和不精确结果 减少质量控制成本 缩短生产周期，降低库存压力64参数放行的实践要求 参数放行须得到政府部门的批准 严格控制和监测灭菌前产品中的微生物污染状况 严格控制灭菌工艺 须用指示剂监控每个灭菌批 须有区分已灭菌和未灭菌产品的系统 容器的密封完好性验证65欧美国家的参数放行美国针对四种灭菌方式湿热灭菌、干热灭菌、环氧乙烷灭菌、辐射灭菌欧洲针对三种灭菌方式湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌不同灭菌工艺的比较Bioburden-based process含菌量控制工艺StabilityStabilityStabilityBiological indicator/bioburdencombined process生物指示剂 /含菌量联合控制工艺SterilitySterilitySterilityOverkill process过度杀灭工艺