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1、第六章 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE,在TEMED 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N-亚甲叉双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。,一、 聚丙烯酰胺凝胶的本质,CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亚甲双丙烯酰胺）,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大
2、小和形状等因素。 1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。,在一定条件下，蛋白质的分子量与电泳迁移率间的关系，可用下式表示：,MW=K（10一）. (1)lgMW=lgK-bmR=K1-bmR (2)式中Mw为蛋白质的分子量，K、kl为常数，b为斜率, mR为相对迁移率.,测定某个蛋白质的分子量，只需比较它和一系列已知分子量的蛋白质在SDS-凝胶电泳时的迁移率就可以了。后来，Weber等人基本按Shapiro的方法对
3、约40种蛋白质进行了研究，进一步证实了这个方法地可行性。用这种方法测定蛋白质的分子量，简便、快速，只需要廉价的设备和微克量的蛋白质样品；所得结果，在分子量为15,000200，000的范围内，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在10%以内。因此，近几年来，SDS-凝胶电泳测定分子量的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。,为了阐明SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理，许多人进行了深入的研究。实验证明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多
4、数蛋白质的结合比为1.4克SDS/1克蛋白质。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。,在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，应注意以下几个问题：1如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4克SDS/1克蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：（1）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一
5、步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。,（2）溶液中SDS的浓度：溶液中的SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。（3）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。,2不同的凝胶浓度适用于不同的分子量范围Weber的实验指出，在5%的凝胶中，分子量25,000200,000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10.00070,
6、000分子量的蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10,00050,000分子量的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%）的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。,可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率）最好在0.20.8之间均匀分布。 在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。,3有
7、许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。,4不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，
8、尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，在分析SDS-凝胶电泳所得的结果时，应该小心。一般至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。为了判断待测样品是否可用SDS-凝胶电泳法来测定分子量，也可以使蛋白质-SDS复合物在不同浓度（交联度相同）的SDS-凝胶中电泳。,如果待测样品的自由迁移率与标准蛋白质的迁移率基本交于一点，而且在不同浓度的SDS-凝胶中测得的分子量都相同，则表明此蛋白质在SDS-凝胶电泳中的行为是正常的，可以用SDS-凝胶电泳法测定其分子量。 SDS-PAGE有连续体系及不连
9、续体系两种，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法1 器材与试剂：1.1 .器材：夹心式垂直板电泳槽，凝胶模（1351001.5mm）（北京六一仪器厂）直流稳压电源（电压300600V，电流50100mA）吸量管（1,5,10 ml） 烧杯（25,50,100 ml）细长头的滴管1ml注射器及6号长针头微量注射器（10l或50l）水泵或油泵真空干燥器培养皿（直径120mm）,1.2 试剂1.2.1 高分子量标准蛋白试剂盒（Pharmacia公司产品) 5种标准蛋白质目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白
10、质成套试剂盒，用于SDS-PAGE测定未知蛋白质分子量。,5种标准蛋白质,5种标准蛋白质,每种蛋白含量为40g。用时加入200l样品溶解，经处理后，上样10l（2g）就能显示出清晰的条带。,1.2.2 低分子量标准蛋白试剂盒,自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。如买不到标准蛋白试剂盒时，可参考常用的标准蛋白质及其分子量表。从中选择35种蛋白质，如马心细胞色素C（Mr12500）、牛胰胰凝乳蛋白原A（Mr25000）、猪胃胃蛋白酶（Mr35000）、鸡卵卵清蛋白（Mr43000）、牛血清白蛋白（Mr67000）等蛋白质，按照每种蛋白0.51mgml样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准
11、液，也可配成混合蛋白质标准液。,1.2.3 连续体系SDS-PAGE有关试剂 0.2molL-1pH7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠(AR)Na2HPO42H2O 25.63g或Na2HPO412H2O 51.58g，再称取磷酸二氢钠(AR)NaH2PO4H2O7.73g或NaH2PO42H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容到1000ml。 样品溶解液：0.01molpH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油或40%蔗糖及0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测固体蛋白质样品。,连续体系样品溶解液配制,如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。,凝胶贮液
12、：称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶，4贮存可用12个月。 凝胶缓冲液：称SDS0.2g，加0.2molL-1pH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4贮存，用前，稍加温使SDS溶解。1%TEMED：取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶内4贮存。 10%过硫酸铵（AP）：称AP1g，加重蒸水至100ml，此液应每周新配，置棕色瓶内，4贮存。 电极缓冲液（0.1%SDS，0.1molL-1 pH7.2磷酸盐缓冲液）：称SDS 1g，加500ml0.2molL-1 pH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1000ml。,1.2.4不连续体系SDS-PAG
13、E有关试剂,10%（W/V）SDS溶液：称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。 1%TEMED（V/V）：取1mLTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4贮存。 10%AP（W/V）：称AP1g，加重蒸水至10ml。最好临用前配制。 样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01molL-1 pH8.0Tris-HCl缓冲液。 先配制0.05molL-1 pH8.0Tris-HCl缓冲液：称Tris0.6g，加入50ml重蒸水，再中入约3ml1molL-1 HCl
14、，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。,凝胶贮液 30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称Acr29.2g及Bis0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。 10%浓缩胶贮液：称Acr10g及Bis0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。,凝胶缓冲液 分离胶缓冲液（3.0molL-1 pH8.9Tris-HCl缓冲液）：称Tris36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加1molL-1HCl约48ml，调pH至8.9，最后加重蒸水定容至100ml，4贮存。 浓缩胶缓冲液（0.5molL-1pH6.7Tris-HCl
15、缓冲液）：称Tris 6.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加1molL-1HCl约48ml调pH至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4贮存。 电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05molL-1Tris0.384molL-1甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。 1%琼脂（糖）溶液：称琼脂（糖）1g，加电极缓冲液100ml，加热使其溶解，4贮存，备用。,1.2.5 不连续体系样品溶解液配制,如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。,2.配胶及凝胶板的制备,2.1配胶 根据所测蛋白质分子量范围，选择适
16、宜的分离胶浓度。由于SDS-PAGE有连续系统及不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法。,电极缓冲液为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，内含0.1%SDS。,电极缓冲液为0.1molL-1pH7.2磷酸缓冲液，内含0.1%SDS。,2.1.1 SDS连续体系凝胶配制,SDS-连续体系凝胶的制备：配制20ml所需浓度的分离胶，用细长头滴管将分离胶混合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm处，插入样品槽模板。为防止渗漏，可在上、下电极槽中加入蒸馏水，但不能超过短板，以防凝胶被稀释，约30min，凝胶聚合，继续放置2030min后，倒去上、下电极槽中的蒸馏水，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可进行预电泳或准备加样。,
